再生障碍性贫血中克隆性造血——我们向何处去

再生障碍性贫血（AA）克隆演变为骨髓增生异常综合征（MDS）或急性髓系白血病（AML）是造血功能衰竭症中的潜在风险，多年来一直被关注。二代测序对于胚系和体细胞突变检测在临床广泛应用，使我们可能早期判断患者向髓系肿瘤转化的高风险，采取更严密监控，甚至提前干预。然而，存在克隆转化风险和克隆性疾病是两个不同概念，对于AA克隆指标如何评判，具体到对疾病病理生理理解、诊断标准掌握，乃至治疗干预采用，给临床医生带来了极大的挑战。本文拟对该领域目前情况做初步述评，供大家参考。

一、AA诊断的挑战

AA诊疗指南近年来屡有更新，但诊断标准依然是1976年的Cammita基于形态学的指标：①骨髓细胞增生程度＜正常的25%；如≥正常的25%但＜50%，则残存的造血细胞应＜30%。②血常规：需具备下列3项中的2项：ANC＜0.5×109/L；校正的网织红细胞＜1%或绝对值＜20×109/L；PLT＜20×109/L。③满足以上标准为重型AA，若ANC＜0.2×109/L为极重型AA，不满足以上者判定为非重型AA。其他非常重要的生物学信息，如免疫学、细胞遗传学和分子生物学并未能有效集成在诊断标准中，仅归于排除诊断。

对照MDS诊断标准变化，我们会发现AA标准极大地落后了。MDS诊断标准自FAB形态学标准提出，后来维也纳诊断方法及标准提出了最低诊断要求。WHO标准提出及更新，提出MDS的系统、多指标和动态诊断指标，包含了细胞遗传学和分子生物学信息。MDS中细胞遗传学不仅用于诊断，而且预后中也应用分了5个亚组。SF3B1基因突变、TP53基因突变和缺失，以及一系列与剪接子复合物、表观遗传学修饰、转录因子信号途径及DNA修复相关等基因均明确与MDS诊断和预后相关。

WHO的2016标准中已明确MDS是一种造血系统恶性肿瘤，当存在典型细胞遗传学核型，以及原始细胞增多时，并不需要形态学显著病态造血存在，即可诊断MDS；而AA有可能存在病态造血，尤其是红系细胞更易见。细胞遗传学核型变化在儿童MDS患者中不常见，成人MDS也只有50%左右（还不包括技术层面的影响）。有报道AA中重现性染色体异常，这里需要着重“重现性”，若一过性，不必在意，可以继续随访。但是若为重现性细胞遗传学异常，实际上依据2016年WHO的MDS标准，应诊断为MDS。

AA诊断确立极大地依赖于排除诊断，而排除诊断依各医疗中心具体情况具体掌握，故AA治疗后出现所谓髓系肿瘤“转化”，亦不能排除原本就是MDS，或者先天性造血功能衰竭症等其他克隆性疾病。以德国多中心儿童AA协作为例，初期发现儿童AA免疫抑制治疗后发生MDS/AML比例，在1998年达23%，而随后改为专科中心诊断，

2011年总结时降为3%。在研读AA中克隆性造血的存在和变化时，病例纳入和对照显得尤为重要，未充分排除其他疾病，必将导致分析结果“奇异”。要廓清克隆性造血是造血功能衰竭发生之前、当时，还是之后病程中，包括是免疫抑制治疗后逐渐发生发展而来的。

二、ICUS/IDUS、CHIP、CCUS以及Pre-MF概念的提出与认识

意义未明的特发性血细胞减少症（ICUS）：持续性血细胞减少症，骨髓形态学不具有明显形态学异常，且缺乏已知的MDS相关的体细胞突变或核型异常；意义不明的特发性病态造血（IDUS）：形态上病态造血显著，但是无血细胞减少，或仅轻度减少，但达不到MDS诊断标准；意义未明的克隆性造血（CHIP）：外周血细胞或骨髓中具有血液恶性肿瘤相关的体细胞突变，但不符合血液恶性肿瘤其他诊断标准；意义未明克隆性血细胞减少症（CCUS）：伴有克隆性突变的ICUS患者。

WHO建议的MDS血细胞减少阈值是：Hb＜100g/L；ANC＜1.8×109/L；PLT＜100×109/L；MDS国际工作组对ICUS的血细胞减少阈值建议是：Hb＜110g/L；ANC＜1.0×109/L；PLT＜100×109/L。

WHO的2016血液肿瘤标准明确了存在早期骨髓纤维化（Pre-PMF），符合以下主要标准：①巨核细胞增生和异形巨核细胞，无显著的网状纤维增多（≤MF-1）。巨核细胞改变同时，必须伴有以粒细胞增生，且常有红系造血减低，骨髓增生程度增高。②不能满足真性红细胞增多症、慢性髓系白血病、MDS或其他髓系肿瘤的WHO诊断标准。③有JAK2V617F、CALR、MPL基因突变。如果没有以上突变，需有其他克隆性增殖的证据，如有ASXL1、EZH2、TET2、IDH1/IDH2、SRSF2等基因突变。以及1条次要标准（需要重复1次）：①贫血非其他疾病伴发；②WBC椌11×109/L；③可触及的脾脏肿大；栜LDH增高。ICUS/IDUS、CHIP、CCUS是某些疾病的某阶段血液和骨髓改变，最后显现的可能是MDS、AML，但也会是其他疾病，结局是多样的。Pre-MF在造血功能衰竭症鉴别中也存在一定漏诊、误诊。临床工作中，我们实际诊断了多少CHIP、ICUS/IDUS、CCUS和Pre-MF？会不会分别被诊断为AA、MDS或者其他血细胞减少症？之前报道的AA克隆转化中，排除了这些ICUS/IDUS、CHIP、CCUS和Pre-MF了么？
三、低危组/低增生性MDS中免疫异常与AA鉴别

约20%的MDS骨髓细胞增生度低于30%，细胞少难以对病态造血进行充分评价，诊断困难，与AA鉴别则更难。其他克隆性证据如细胞遗传学、分子生物学指标此刻就显得非常重要，实验室结果判断和解读，对临床医生提出了极大挑战。常有报道低危MDS，尤其是低增生性MDS对免疫抑制治疗有效，并且起效确实与T淋巴细胞去除和抑制相关，这与AA免疫抑制反应过程和机制相似。理论假说如下：MDS克隆的抗原改变激发了T细胞针对MDS克隆免疫攻击，但是MDS作为恶性克隆获得了免疫逃逸，正常克隆由于“无辜旁观者效应”而被损伤。比如染色体三体8细胞对淋巴细胞介导的凋亡很敏感，在去除T淋巴细胞或加入环孢菌素培养后显著扩增。还有报道AA在免疫抑制治疗后数月内发生MDS，提示免疫监视抑制恶性克隆，在免疫抑制剂使用后免疫监视作用缺失，使MDS发生。联系到AA在老年人群亦存在第2个发病高峰，与MDS、年龄相关的克隆性造血峰度类似。那么是不是就按照有些学者建议，干脆给这类血细胞减少症患者冠以“低增生MDS/AA综合征”这样一个名称，避开在诊断上的疑难和纠结。

但实际中是不妥的。对于疾病诊断及鉴别诊断而言，应该务求精准，只有明确的诊断，才能够有精准的预后和适合患者的治疗方案。同样免疫抑制治疗，AA患者血象恢复后能达到缓解乃至治愈，而对于MDS是不可能治愈患者的（杀伤和抑制T淋巴细胞的药物不可能清除髓系肿瘤细胞），部分患者甚至会迅速出现疾病进展。即使是选择异基因造血干细胞移植，AA和MDS预处理方案也应有所不同。从疾病研究角度看，将肿瘤和非肿瘤性疾病混在一起，得出的结果必然是糊涂和混乱的。从疾病诊断与分类，发展方向是越来越细致明确乃至精准，向来是从综合征中摘出有明确特质具体疾病。若再变回，是开倒车，不合适。在造血功能衰竭症这样的一个极大异质性群体中，无论从临床，还是从研究出发，需要我们进一步去理清各个亚组和亚群。

四、AA中发现的克隆性造血特点及意义

AA中评价存在造血克隆目前有：FLARE测定PNH克隆、细胞遗传学、克隆拷贝数中性杂合性缺失（CN-LOH）和二代测序。依FLARE技术敏感性，50%左右的AA能测到存在PNH克隆。AA中PNH克隆发生在造血干细胞阶段，在髓系、B细胞以及T细胞均可以找到PIG-A基因突变，但MDS合并PNH克隆首先是在较低危组患者，不见于RAEB-1和RAEB-2患者，另外克隆发生阶段基本是造血祖细胞，所以克隆规模不稳定，出现后消失，或者是发现PNH样细胞，但是PIG-A基因检测不能够确立干细胞克隆存在。AA中细胞遗传学异常发生率各家报道不一，多数不超过5%（也有在20%以上的）。

常见累及核型为：-7/del（7q）、三体8、del（13q）、三体6、三体15和三体21。-7/del（7q）对免疫抑制治疗效果差，易向MDS转化，而三体8、del（13q）合并PNH克隆，常常预示对免疫抑制治疗有较好效果。

虽然在WHO关于MDS诊断中提出，del（20q）患者若无显著病态造血，且对免疫抑制治疗有较好反应，建议诊断考虑为AA，但AA中del（20q）比例并不高。G-CSF长期大量使用，艾曲波帕治疗患者中-7/del（7q）发生增加，但这是药物引发，还是由于疾病自身生物学异常（难治性AA患者）而导致，尚待前瞻性研究明确。使用SNP-A技术发现AA患者6号染色体短臂存在CN-LOH改变，累及了主要组织抗原复合物位点，导致特殊的人类白细胞抗原（HLA）等位基因缺失，包括HLA-A*02：01，-A*02：06，-A*31：01，-B*40：02和-B*14：02，提示与AA免疫发病机制可能关联。6号染色体的CN-LOH改变，在AA中相对特异，发生率为11%，在MDS中约1%，而在健康人群中极为罕见。AA发生CN-LOH者，在亚洲人群预示免疫抑制治疗良好反应，但是欧美尚无一致性结果。

Kulasekararaj等对57例AA进行835个与造血功能衰竭或髓系肿瘤相关的体细胞突变基因进行筛查（不含PIG-A基因），随后在93例患者中验证。29例（19%，29/150）发现有基因突变：ASXL1（12例）、DNMT3A（8例）、BCOR（6例）、TET2、MPL、SRSF2、U2AF1、IKZF1和ERBB2各1例；伴有突变AA患者病程更长（37个月vs8个月，＜0.04）。Babushok等用全外显子组测序技术，对22例获得性AA配对骨髓和皮肤标本比较，16例（72.7%）体细胞突变，12例（66.7%）儿童患者；51个基因中出现58种突变，涉及了免疫和转录途径的调控；PIG-A基因突变最常见，与MDS相关突变仅2个。该研究认为克隆性造血在AA发病前即存在，此结果需要进一步解读，是否如同PNH克隆一样，在免疫攻击下获得选择优势。
Yoshizato等对AA全外显子测序结果与Kulasekararaj等结果类似，最常见是BCOR和BCORL1，PIGA，DNMT3A和ASXL1。若不包含BCOR/BCORL1和PIG-A突变，其余基因突变频度和突变数均随年龄而显著增高，与人群中获得的测序结果相类似。单因素和Logistic回归分析显示，BCOR/BCORL1和PIG-A突变是免疫抑制治疗良好反应组；不良突变组最差（包括ASXL1、DNMT3A、TP53、RUNX1、JAK2、JAK3和CSMD1）；无突变组居中。Cox风险回归模型分析，良好体细胞突变与较佳生存率有关，而不好的体细胞突变，以及高龄、男性和较低初始网织红细胞数与较差生存率相关。

五、展望

目前可以判断的是，AA会发生克隆性造血，但不是克隆性疾病，其克隆性标志谱与MDS、AML不同，负荷量也偏低；AA中出现的主要克隆性标志：PNH克隆、CN-LOH、三体8、BCOR/BCORL1和PIG-A突变均与免疫调控关联，显示出AA内在特有的病理生理异常；二代测序的突变基因需评价突变频度和等位基因负荷量，并持续监控；基因突变和蛋白质功能变化之间尚有距离，此过程中掺杂的细胞生物学事件也是复杂的，需要我们以多指标，动态关注。

最后，目前的基因数据库建设时间尚短，库容量不足够大，而且以西方人群数据为主。对于AA等在亚太地区更相对特殊疾病，还需要该地区的大容量和长期数据作为背景解读。这也是我们工作之中合作努力的方向之一。

来源：临床血液学杂志，作者：何广胜;吴雪梅
原标题《再生障碍性贫血中克隆性造血——我们向何处去》