Nat Rev Genet. :环状RNA的合成与功能,与糖尿病、神经系统疾病、心血管疾病和癌症等疾病有关
2019-11-09 gladiator BioArt
环状RNA(circular RNA，circRNA)是一种新兴的内源性非编码RNA(noncoding RNA，ncRNA)，是继microRNA (miRNA)以及long noncoding RNA (IncRNA)后非编码RNA家族中极具研究潜力的新成员。越来越多的研究表明，环状RNA具有种类丰富、结构稳定、序列保守以及细胞或组织特异性表达等特点。近年来，随着RNA研究技术的进步，研究者们
环状RNA(circular RNA，circRNA)是一种新兴的内源性非编码RNA(noncoding RNA，ncRNA)，是继microRNA (miRNA)以及long noncoding RNA (IncRNA)后非编码RNA家族中极具研究潜力的新成员。越来越多的研究表明，环状RNA具有种类丰富、结构稳定、序列保守以及细胞或组织特异性表达等特点。近年来，随着RNA研究技术的进步，研究者们在多种生物中发现了数量众多的环状RNA，且发现它们具有重要的生物学功能，例如作为天然小RNA(miRNA)海绵体吸附并调控miRNA的活性，与转录调控元件结合或与蛋白互作调控基因的转录等。已有研究表明，环状RNA与糖尿病、神经系统疾病、心血管疾病和癌症等疾病有关，因此具有重要的研究价值。此外，环状RNA的广泛表达和疾病调控机制使其成为多种疾病的功能生物标志物和治疗靶点。
近日，丹麦奥胡斯大学分子生物学和遗传学(MBG)系Lasse Kristensen等研究人员在Nature Revies Genetics杂志上发表题为The biogenesis， biology andcharacterization of circular RNAs综述。在这篇综述中，作者首先介绍了环状RNA的生物发生及特征，随后介绍了环状RNA的鉴定方法，并对环状RNA涉及的生物学功能以及目前确定其功能的研究方法进行了详细总结。
对环状RNA认识观念的转变
1976 年，当Sanger首先在植物类病毒中发现了共价闭合的环状RNA，以及1979年Hsu 通过电镜在HeLa细胞细胞质发现了类似的环状转录本时，人们一度认为环状 RNA只是错误剪接的产物，也就是垃圾DNA。直至1993年，Capel发现小鼠Sry (sex-determining region Y)基因的环状RNA可能在小鼠睾丸发挥特定功能，环状RNA才真正进入科学研究领域的视野，并逐渐成为研究的焦点。特别是近年来，随着高通量测序和生物信息学分析技术的发展，环状RNA的研究已经上升到了一个新的高点。
环状RNA的一般常识
通常来说，大多数环状RNA是由已知的蛋白基因编码，且由一个或者数个外显子组成。环状RNA主要是通过头对尾的反向剪接方式产生，但是在环状RNA上也会发现线性RNA选择性剪切的一些基本特征，然而一些环状RNA还会包含一些不会出现在线性RNA上的外显子序列。由于其不含有帽子结构和polyA尾巴，环状RNA主要定位于细胞质中。但是一些不同来源的环状RNA，比如外显子？内含子环状 RNA (exon-intron circRNA， EIciRNA)和仅内含子来源的环状 RNA (circular intronic RNA， ciRNA)则会定位于细胞核。可能是由于它们独特的环状结构，环状RNA比线性RNA更稳定，这也是导致其耐核酸外切酶的降解机制，并最终可以实现环状RNA在某些特定的细胞中累积。一般而言，环状RNA表达水平较低，有趣的是，在神经发生过程中有很多环状RNA上调，一些环状RNA在突触中富集。相比之下，环状RNA在癌症及一些其他疾病中则会出现下调。有可能是因为受这些疾病中的细胞增殖速率较快的影响，环状RNA尚未达到稳定水平。到目前为止，环状RNA被证明与多种人类疾病有关，包括糖尿病、神经系统疾病、心血管疾病、慢性炎症和癌症。此外，还发现环状RNA在衰老的过程中会不断累积。
环状RNA的生物发生及特征
环状RNA的生物发生
环状RNA主要由前体RNA（pre-mRNA）通过可变剪切加工产生。尽管反剪接被认为是一种选择性剪接，但它与线性选择性剪接具有不同的分子机理。目前有关环状RNA的生物合成机制仍然未全面阐明。
环状RNA的发生不仅依赖于经典的剪接性位点，同时还依赖于经典的剪接性机制。反向剪接的剪接信号和剪接体与经典的RNA剪接的类似，反向剪接与经典的RNA剪接具有一定的竞争关系（图1）。当pre-mRNA处理事件减慢时，新生的RNA可以被导向另一种途径以促进反剪接。比如，对果蝇细胞的研究表明，通过减少U2 snRNP抑制剪接体可显着增加环状RNA与线性RNA的比值。此外，另外一项研究也表明消耗剪接因子可以增加环状RNA的水平。当多个因子被耗尽时，可以观察到加性效应，因此每个剪接因子在环状RNA的形成过程中均发挥一定作用。
反向剪接的假说主要是下游剪接位点反向与上游剪接位点连接形成的闭合环状RNA分子。这主要通过反向重复元件（例如Alu元件）之间的碱基对、RBPs的二聚或RBPs与侧翼内含子中的特定基序结合使下游剪接给体位点(SD)与上游剪接受体位点(SA)接近（图1 a），也就是通常所说的内含子配对驱动环化和RNA 结合蛋白驱动环化。其次，外显子跳读所形成的套索驱动环化也是环状RNA生成的一种机制。此外，剪接过程中从分支结构脱离的内含子索套也会产生环状RNA（图1 b）。
目前研究发现环状RNA的形成是受多个因素调控的，是受包括异质性核糖核酸蛋白(hnRNPs)和SR蛋白(即含有长重复丝氨酸和精氨酸氨基酸残基的蛋白)在内的顺式作用元件和反式剪接因子的联合作用。还有一些蛋白或分子会参与环状RNA的调控，比如，ADAR（防止先天免疫系统激活功能的双链RNA (dsRNA)特异性腺苷脱氨酶）通过与双链 RNA 相结合将腺嘌呤核苷编辑为次黄嘌呤核苷，以及依赖ATP的RNA解旋酶A(也称为DHX9)通过反向重复之间碱基配对抑制环状RNA的生物发生。也有一些蛋白或分子可以促进环状RNA的和形成，例如，长侧翼内含子、反向重复元件(如Alu元件)和反式RNA结合蛋白（RBPs；例如RNA结合蛋白FUS、震动蛋白 (HQK)、NF90和NF110，这些均是白细胞介素增强子结合因子3基因的蛋白产物，它们都有助于反向剪接。此外，组蛋白和基因体的表观遗传变化会影响选择性剪接，也可能会造成对环状RNA的生物发生的直接影响。比如近期的一项研究就表明DNMT3B作为DNA甲基化维持所必需的关键甲基转移酶，对其敲减以后发现环状RNA表达的变化，而这些变化与相应的线性宿主基因表达的变化无关。
环状RNA的特征
环状RNA的亚细胞定位
正如前文所述，绝大多数环状RNA在细胞质中富集，少数定位于细胞核内。环状RNA是通过ATP依赖性RNA解旋酶DDX39A（也称为RNA解旋酶URH49或URH49）和剪接体RNA解旋酶DDX39B（也称为DEAD盒蛋白UAP56或UAP56）从细胞核转运至细胞质的。在人类细胞中，UAP56负责转运较长的circRNA（> 1，200个核苷酸）而URH49转运较短的circRNAs（<400个核苷酸）；然而，将环状RNA从细胞核到细胞质，不同的物种可能对于环状RNA长度的要求可能是不同的。
环状RNA的稳定性
RNA呈闭合环状结构，不易被核酸外切酶降解，比线性RNA更加稳定。目前对于其的降解机制仍知之甚少，初始数据表明含有m6A的环状RNA可被核糖核酸酶P复合体以一种依赖于含有YTH结构域的家族蛋白2 (YTHDF2)和热敏蛋白质12 (HRSP12)的方式降解，并且在病毒感染时，环状RNA几乎全部经RNase L降解。此外，miR-671可能与CDR1AS结合促进AGO2裂解环状RNA，同时，miR-7还可通过招募miR-671促进对环状RNA 的降解，尽管目前对于其可能的相关机制并不是十分清晰。对人类细胞的研究表明还可能通过将环状RNA以活性物质输出也是一种清除机制。以一些近期研究为例，研究人员发现ciRS-7和circHIPK3在胞外囊泡的含量较高，但目前还不清楚这是否会显着降低细胞水平上环状RNA的含量。更加有趣的是，小型环状RNA被积极地经囊泡介导的输出，例如ciRS-7可以在细胞外囊泡中保留其环状性质，并在受体细胞中释放后发挥作用，这表明，环状RNA的输出可能对细胞间通讯是很重要的。
发现及鉴定环状RNA的技术
目前，对于环状RNA的经典研究策略主要是通过对去除核糖体，如RNARibo-Zero技术捕获captures rRNA进行全基因组环状RNA分析。但是基因组以及位点特异性环状RNA分析技术也存在一定的缺陷，这类方法只能识别环状RNA上特异的反向连接区域（BSJ），但不能检测到内部剪切模式。同时，大多数检测环状RNA的方法均会涉及逆转录以及PCR扩增，这些均会导致一定的错误或偏倚发生。此外，有些时候还需要通过RNA酶R处理线性RNA，但是某些线性RNA由于其二级结构可能会对RNA酶R耐受。本综述就近期一些新的研究方法就行分析讨论。
环状RNA全基因组分析
测序 用去核糖体RNAs (rRNAs)和使用随机引物的RNA-seq，是早期鉴定circRNA的主流方法。该方法的优点是可以同时获得非编码和编码RNA的表达信息，但该方法需要深度测序才能获得足够的信息。因此，我们建议至少进行100 bp测序，以获得足够的读长，从而能够基于BSJs跨读区对环状RNA进行准确的预测。
生物信息学 在生物信息计算方面，目前已经开发了多种算法对环状RNA进行预测。CIRI2算法目前被认为是最好的独立算法，但是研究发现单个软件往往因为算法的设计问题在某些方面存在着一定的局限性，建议同时使用2个及以上的软件进行环状 RNA 的预测。
基因芯片 另外，包含有反向剪接探针的芯片技术也可以作为RNA-seq技术的一种替换手段。第一个商业化的环状RNA芯片来自于 Arraystar公司。其circRNA来源融合了环状RNA研究的最新顶尖文献，所有cicrRNA都经过了严谨的实验验证，以便于对不同生理及病理条件下的circRNA进行系统的研究。
环状RNA位点特异性分析
依赖于对BSJs基因组位置的环状RNA的位点特异性检测，可用于验证全基因组实验的数据，或研究以前环状RNA的特征。许多常用的分子生物学技术已被应用于环状RNA的检测，然而，每种技术在这一领域都有各自的优缺点。以作为验证环状RNA的金标准Northern blotting为例，该方法不需要反转和扩增步骤，并可对探针进行个性化设计。但是却需要大量RNA，而且耗时耗力，且需使用放射性标记探针。因此，人们更倾向使用覆盖BSJ的不同引物的RT-PCR检测环状RNA。如果需要对环状RNA进行定量分析，一般也采用定量PCR (RT-qPCR)。但目前尚无商化的RT-qPCR检测和定量试剂，因此，可能需要精心设计、优化和验证这些方法。在RT过程中通过滚动扩增形成的串联体，可能会影响RT-qPCR对环状RNA的准确定量。而最近出现的数字PCR或许可以避免这一问题，并且对一些难度较大的样本，例如血浆，可能更具有优势。Nature子刊Laboratory Investigation在线发布了一项circRNA的定量分析技术，基于NanoString nCounter 荧光条形码标记检测技术实现circRNA绝对定量分析，该技术灵敏度较高，稳定性好，而且具有一定的通量。NanoString nCounter技术使用的两种探针长度在35-50nt，设备经条件优化后一次性可检测800个分子。该技术中的捕获探针带生物素标记，报告探针带四色荧光基团，可通过不同的排列组合方式实现标记。检测过程中将总RNA与两种探针杂交，纯化，固定后扫描后得到表达量的结果。该技术可实现从福尔马林固定石蜡包埋样品中提取RNA的定量，因此有望成为circRNA检测的新金标准。
环状RNA的可视化
由于环状RNA的亚细胞位置上呈多样化，此外，某些circRNA具有独特的亚细胞位置，有可能是全新的亚细胞构成。因此，原位杂交技术（ISH）被广泛运用于对环状RNA的检测及定位。一般来说，ISH探针要跨越BSJ，以便清楚地识别circRNA在哪些组织中表达很高，作为组织特性判断的依据。此外，为优化ISH技术，还可以对多固定的样本进行蛋白酶K和RNA酶R预处理。小干扰RNA (siRNA)介导的circRNA或mRNA对照样品的敲除可用于测试样品中的非特异性结合的估算。BaseScope技术及试剂盒利用了改进的探针专利技术可产生更强信号的同时亦可抑制背景噪音，并以单分子检测灵敏度检测某个特定RNA位点。另一种对特定环状RNA成像和跟踪的方法利用了用一种催化死亡的Cas13a(以前称为C2c2)与荧光蛋白（如增效绿色荧光蛋白）(EGFP))结合的技术，该方法类似于CRISPR Cas9在基因组工程中的应用，死亡Cas13a对目标RNA88保持着很高的亲和力，因此可以作为一种基于导向RNA的可编程RBP，但是该方法也存在一定的局限性。
环状RNA的功能
大量的研究表明circRNA在生物的生长发育、胁迫应答、疾病发生和发展等方面密切相关，并预测其在疾病诊断标记物等方面的应用前景，但其生物学功能在很大程度上仍然未知。目前认可度比较高的circRNA生物学功能主要包括环状RNA作为miRNA sponge、单个环状RNA调控蛋白结合、环状RNA与蛋白质相互作用的协同作用及编码功能，本文就以上几方面对环状RNA的功能做一介绍。
单个环状RNA作为miRNA sponge
近年的研究表明，环状RNA分子富含microRNA（miRNA）结合位点，在细胞中起到miRNA海绵（miRNA sponge）的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平，这一作用机制被称为竞争性内源RNA（ceRNA）机制（图2a）。研究表明，含有许多竞争性结合位点的高度丰富的环状RNA更有可能具有竞争性的内源性RNA功能，比如在许多组织中，特别是在大脑中，都有高度稳定的表达的ciRS-7含有超过70个miR-7的结合位点，通过AGO2 蛋白实现竞争性吸附miR-7进而调控靶基因。研究发现ciRS-7敲除小鼠中miR-7水平显着地下降，但是其它一些研究发现ciRS-7表达与miR-7表达呈负相关。有趣的是，在ciRS-7敲除小鼠中包括miR-7靶基因Fos在内的早期基因会出现上调，而ciRS-7敲除小鼠表现出与神经精神疾病相关的行为表型。值得注意的是，尽管有些环状RNA有miRNA sponge的特征，但是它们所含有的结合位点却比预期较低。
环状RNA还有可能在细胞分化过程中诱导产生，比如circZNF91，它和ciRS-7一样具有多个与miRNA的结合位点（circZNF91包含与miR-23b-3p结合的24个结合位点）。但是一些肿瘤领域的研究显示，单个环状RNA可能具有与多个miRNA的结合位点，而不是仅包含与一个特定miRNA结合的多个位点。有一种假说认为，分化细胞中较高水平的环状RNA可能与大量的miRNA进行协同作用，但这一假说尚未得到实验验证。
单个环状RNA作为蛋白sponge调控蛋白结合
有些环状RNA上有一个或者多个RNA结合蛋白的结合位点，可作为蛋白分子的海绵体（图2b）。第一个例子来自于对黑腹黑腹果蝇中编码mbl的剪接因子蛋白基因的研究。MBL能促进circMbl的合成，且合成的circMbl上存在特异性的MBL结合位点。当MBL高表达时，会促进circMbl的生成而抑制了线性转录本的表达；并且circMbl会与过量的MBL结合，使其含量趋于稳定。因此，可能存在一种自调节回路，其中过量的mbl或MBNL1通过促进环状RNA的生物发生而降低自身mRNA的产生，环状RNA通过与mbl或MBNL1的连接促进基因的线性剪接。
还有一些环状RNA能够与蛋白相互作用抑制翻译进程，如circPABPN1通过在人宫颈癌HeLa细胞s93中与RBP hu抗原R (HUR)隔离，抑制核多聚(A)结合蛋白1 (PABPN1) mRNA的翻译；circANRIL通过与pescadillo同源物1 (PES1)结合，抑制rRNA前处理和核糖体生物发生。另外一项研究表明环状RNA能够与核cGAS结合阻止它与自身DNA结合。还有一些环状RNA，如circ-Amotl1和circFOXO3可以作为作为蛋白质支架，促进酶及其底物的共域化。CircFoxo3上同时存在 MDM2 (mouse double-minute 2)和 p53的结合位点，circFoxo3 能促使MDM2诱导的p53的泛素化，导致p53蛋白的整体降解。最后，环状RNA可能会将特定的蛋白质招募到特定的细胞位置，例如来源于FLI1基因的环状 RNA(FECR1)，能特异性地与FLI1启动子区域结合，并招募去甲基酶TET1诱导该区域的去甲基化。
环状RNA与蛋白质相互作用的协同作用
细胞质中多个环状RNA与特定蛋白的协同结合可能形成一个蛋白质分子库，对细胞外刺激做出快速反应。这样可用于在病毒感染时使免疫反应迅速，以NF90/NF110为例，它在细胞质中更容易与环状RNA分子结合，由于环状RNA分子稳定的特性进而导致NF90/NF110在分子水平的累计。与此类似的还有不少内源性的环状RNA在抗病毒反应中发挥作用。有的circRNAs与免疫响应相关，外源性的环状RNA可以通过激活模式识别受体RIG-I刺激哺乳动物细胞的免疫信号。之前的研究认为细胞区分内源性和外源性环状RNA的能力依赖于环状rna侧面的内含子序列和剪接机制，但是近期研究发现与之矛盾的结果，即外源性环状RNA不激活细胞RNA传感器，如toll样受体和RIG-I。本综述认为，在以前的研究中，使用RNase R生成的circRNA制剂中的杂质可能激活了RNA传感器，因为即使是少量污染的线性dsRNA(其中一些可能含有三磷酸化的dsRNA)也能激发强大的细胞免疫反应。
环状RNA的编码功能
由于circRNAs不含5’帽子，它的翻译是帽子独立的。某些circRNAs具有内部核糖体进入位点（IRES）或者在5个未翻译区域(UTR)加入m6A RNA修饰后的方式翻译。尽管目前有成千上万的环状RNA经预测包含一个假定的开放阅读框(ORF)和一个上游IRES，但是真正能够作为蛋白编码模板的，只有circ-ZNF609， circMbl， circFBXW7， circPINTexon2 和 circ-SHPRH，对于它们所产生的肽段的功能也尚不清晰。FBXW-185aa， PINT87aa和SHPRH-146aa作为人胶质母细胞瘤的肿瘤抑制因子发挥功能。另外一些环状RNA编码的产物还可能作为防止蛋白降解的保护剂，如SHPRH-146aa可保护全长E3泛素蛋白连接酶SHPRH蛋白不被DTL泛素化并降解。环状RNA衍生肽也可以在不同的条件下表达，如在细胞应激时，或在典型蛋白的不同细胞间隔中发挥作用，从而作为细胞内的调控蛋白产物。
研究环状RNA的功能的策略
类似于线性RNA和其它非编码RNA，研究人员均试图通过实验操纵环状RNA的表达水平和表征它们的相互作用来阐明环状RNA的功能。但是研究环状RNA有一定的难度，因为环状RNA可能会干扰来自同一位点的线性转录本的研究。本文就研究环状RNA特征的一些研究方法进行讨论。
研究环状RNA-miRNA相互作用的方法
证明环状RNA作为miRNA海绵的功能是具有挑战性的。在环状RNA中存在假定的miRNA结合位点并不一定意味着环状RNA抑制这些miRNA。首先，可能需要考虑海绵中miRNA结合位点与靶mRNA之间的化学计量关系；同时，环状RNA需要具有多竞争性miRNA结合位点。Argonaute-交联免疫沉淀或Argonaute免疫沉淀常被用于证明环状RNA是否具有真正的miRNA海绵作用。但该方法的缺陷是不能区分与之结合的是线性还是环状RNA。因此，还需要经特殊引物设计的RT-qPCR进行量化。此外，单纯的结合还不能说明环状RNA就是miRNA的海绵，同时还需要证明Ago-环状RNA的联系是随着miRNA的表达水平发生变化的。
研究环状RNA-蛋白相互作用的方法
评估环状RNA蛋白相互作用的方法是基于环状RNA (以RNA为中心)或蛋白(以蛋白为中心)的分离，然后分析分离组分的相互作用。在以RNA为中心的方法中，利用RNA反义纯化、RBPs的综合鉴定或RNA目标的捕获杂交分析等技术，利用反义探针从细胞裂解液中提取环状RNA及其相关蛋白。环状RNA相关蛋白可通过低通量方法(如western blot)或高通量方法(如质谱分析)进行分析。在以蛋白为中心的方法中，免疫共沉淀可采用针对该蛋白的抗体，与该蛋白相互作用的环状RNA可以通过特定于位点的方法或高通量方法(如RNA-seq)进行分析。为了利用基于交联免疫沉淀(CLIP)的方法在环状RNA上绘制精确的蛋白结合位点，必须在免疫沉淀前有效地去除线性RNA。
研究环状RNA翻译的方法
大多数环状RNA是由编码蛋白质的基因产生的，环状RNA中假定的ORF与相应mRNA序列中的典型ORF经常重叠。因此，只有BSJ下游的序列和假定的终止密码子之前的序列，才能用于确定蛋白质是来自线性转录本还是环状转录本。因此，评估环状RNA是否被翻译，可以使用荧光素酶报告基因测定ORF和功能类似的IRES的元件，及通过对m6A甲基化的分析。此外，跨越BSJ的环状RNA特异性肽段最好采用质谱法检测。此外，一些最新的研究方法还可以为环状RNA的ORF终止密码子前插入蛋白标签，以利于后续的蛋白鉴定或者细胞定位。还有多聚体分析或核糖体印迹也可以作为研究环状RNA翻译的方法。
RNAi敲低环状RNA的方法
为验证目的环状RNA的功能，可以使用RN干扰技术来有效沉默或抑制环状RNA的表达，即由siRNA/shRNA与环状RNA结合并使之降解。针对环状RNA BSJ的siRNAs通常对环状转录本有效且特异性强，使用化学修饰的siRNAs，如锁定核酸和解锁核酸可以提高敲除效率或减少脱靶效应。但是针对BSJ时，设计空间受到限制，使用passenger disabled siRNA可能效果较好。由于siRNAs依赖于高转染效率，且具有瞬时转染的特点。相比之下，采用shRNAs或者AgoshRNAs可能会更稳定地敲低环状RNA。
敲除环状RNA的方法
由于大多数环状RNA来自于编码蛋白质的宿主基因，这使得环状RNA特异性敲除较为复杂。即使对于没有注释宿主基因的环状RNA，如ciRS-7，在敲除环状RNA时也应谨慎。由于ciRS-7没有已知的线性宿主基因，因此通过去除产生环状RNA的外显子，产生了一个ciRS-7敲除小鼠模型。然而，最近的分析鉴定出一种与ciRS-7同源的线性RNA，并表明在ciRS-7敲除模型中该线性RNA的稳态水平增加。这一发现提出了一个问题，ciRS-7敲除小鼠的表型是由于ciRS-7丢失还是线性RNA表达增加所导致的。
过表达环状RNA的方法
根据内源外显子环化的原理，构建环RNA过表达载体，研究侧翼内含子序列、蛋白因子等对环化的促进或抑制作用，可以探索环状RNA的功能。互补序列可以发生在重复元件中，例如Alu元件，可以通过获取上游内含子的一个区域(>30核苷酸)
，并将其反向插入循环外显子的下游来创建互补序列。另一种有利于质粒表达环状RNA转录本的方法是将特定RBPs的结合域包含在侧翼内含子中以促进循环。最后，基于转移RNA剪接机制的方法可以实现环状RNA过表达。环状RNA过表达载体包含可环化外显子和具有反向互补序列的侧翼内含子来促使环化剪接，其转染到细胞中可以主动促进成环。然而，这种方法通常导致环状RNA表达位点的随机插入，可能会干扰其他基因。此外还需注意一点，就是线性转录本和循环串联体通常一起产生的，应该对产生的线性和环状转录本的数量进行实验评估，并谨慎解释数据。
结语
环状RNA研究领域的最新进展已经揭示了环状RNA生物发生和生物学方面的核心内容，但要了解这些分子在健康组织和疾病中的调控和功能，仍需要进行更加深入的研究。在特定细胞类型或亚克隆中确定空间和时间基因表达模式，特别是在单细胞水平上，将有助于这项工作。目前，单细胞RNA-seq仅在两个研究中仅被用于检测环状RNA，但在未来可能会被更多地用于环状RNA的生物学研究。另一项很有前途的技术，数字空间剖面是基于NanoString技术的一个名为GeoMx数字空间剖面仪的平台，该平台支持在福尔马林固定石蜡包埋组织玻片上对用户感兴趣的定义区域的蛋白质或mRNA进行高度复用和空间解析的数字分析。在未来，我们希望这项技术能够应用到对环状RNA的量化。最后，Oxford Nanopore MinION技术已经被用于环状RNA的扩增测序，并有望在不久的将来应用于全基因组的环状RNA测序，该技术可以提供非常长的读序，因此可以解决内部剪接模式的问题。
对环状RNA的研究给我们带来了许多令人惊讶的发现，这意味着环状RNA在生物学和病理生物学中具有重要的意义。RNA-seq已经在不同的组织和疾病中发现了数千种环状RNA，然而其中绝大多数还没有得到其它技术的验证或功能研究。本综述中描述的技术将会促进RNA-seq数据的有效验证，并有助于揭示环状RNA生物学的新方面。
原始出处：
Kristensen LS1,2, Andersen MS3,4, Stagsted LVW3,et al.The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs.Nat Rev Genet. 2019 Nov;20(11):675-691. doi: 10.1038/s41576-019-0158-7. Epub 2019 Aug 8.
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