P Natl Acad Sci USA：百年验证，可行！溶瘤病毒登上“抗癌舞台”，是癌症免疫疗法
2017-08-06 佚名 生物探索
2006年，中国批准世界首个溶瘤病毒上市；2015年，安进肿瘤疫苗T-Vec成为美国FDA批准的首个溶瘤病毒疗法。经过一百多年的努力，溶瘤病毒这一“老概念”终于有了“新生命”。本专题回顾了这类“以毒攻毒”的疗法登上“抗癌舞台”的历程，同时分析了开发这类癌症免疫疗法所面临的独特挑战。
2006年，中国批准世界首个溶瘤病毒上市；2015年，安进肿瘤疫苗T-Vec成为美国FDA批准的首个溶瘤病毒疗法。经过一百多年的努力，溶瘤病毒这一“老概念”终于有了“新生命”。本专题回顾了这类“以毒攻毒”的疗法登上“抗癌舞台”的历程，同时分析了开发这类癌症免疫疗法所面临的独特挑战。
自1991年《科学》杂志报道了第一个基因工程的溶瘤病毒（Oncolytic viruses）以来，经过二十多年的发展，这类抗癌新疗法已经迈入了新的发展时期。2006年，中国批准了世界上第一个溶瘤病毒（重组人5型腺病毒H101）上市，用于治疗晚期鼻咽癌。2015年，安进公司用于治疗晚期黑色素瘤的肿瘤疫苗T-Vec正式获批，成为美国FDA批准的首个溶瘤病毒疗法。
T-Vec的上市进一步证实了溶瘤病毒作为抗癌疗法的可行性，同时也“唤醒”了这一领域的发展，使得投资企业和制药公司对这类疗法的兴趣和投入迎来了“高潮”。报告显示，2016年，对溶瘤病毒公司的总风险投资和私人投资比2010年高出近17倍。
本专题，探索君带大家一起回顾溶瘤病毒发展的“百年历史”，同时为大家解析这一“以毒攻毒”疗法的抗癌机制、最新研发现状、独特的开发挑战、需要解决的应用难题。此外，专题还特别跟踪了此前备受瞩目的、由我国中山大学颜光美教授研究组提出的M1病毒的最新进展。
1百年验证“以毒攻毒”
根据维基百科的定义，溶瘤病毒是一类能够优先感染和杀死癌细胞的病毒。事实上，用病毒来治疗癌症并不是新鲜的想法。溶瘤病毒的发展大致经历了3个阶段：
溶瘤病毒开发的第一个阶段主要是直接使用野生病毒进行研究。100多年以前，有医生在临床上观察到偶然的病毒感染使得肿瘤消失的现象。这使得人们开始猜想，是否病毒感染能够用来对抗癌症。于是，开始有医生直接往癌症患者体内打活体病毒。一个个失败的案例证明，所谓“以毒攻毒”的抗癌策略并没有想象的那么简单。
随后，到上世纪中期，一些主动的临床试验用各种野生的病毒感染来治疗肿瘤并观察到一定的疗效。但是这类早期的溶瘤病毒通常只能产生短期的溶瘤效应，而且不可避免地具有野生病毒感染造成的毒副反应。短期的溶瘤效应可能是限于野生病毒的毒性：临床使用的病毒滴度比较低；因此，病毒还没有来得及有效地溶瘤就被病人的免疫系统清除了，其结果是残余的肿瘤很快又长了回来。
溶瘤病毒开发的第二个阶段始于上世纪90年代；受益于分子病毒学的发展，人们开始能够选择性地改造野生病毒的基因组，使之特异性地在肿瘤内复制。在过去20几年里，有许多类似的溶瘤病毒进入了临床试验，但是绝大部分都由于缺乏显着疗效而在临床I/II期失败了。但值得一提的是，在近百个溶瘤病毒的临床研究中，没有发现一例因病毒而引起的严重毒副反应。因此，尽管在这个阶段未能有真正的溶瘤病毒新药脱颖而出，溶瘤病毒的安全性却得到了充分的承认。
溶瘤病毒开发的第三个阶段主要从本世纪开始，其特点是让溶瘤病毒携带各种外源性基因以增强其疗效。目前看来，最有效的外源性基因就是免疫刺激基因，例如GM-CSF（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）。T-VEC获FDA批准上市证明了这种“改进”的有效性。据悉，T-Vec注射到肿瘤组织后可在肿瘤细胞中大量复制并释放GM-CSF。T-Vec能够让细胞溶解或死亡，使肿瘤释放肿瘤特异性抗原，与GM-CSF共同促进抗肿瘤免疫反应。
2一种癌症免疫疗法
溶瘤病毒究竟是如何发挥抗癌作用的呢？越来越多的研究表明，溶瘤病毒不仅会直接破坏肿瘤细胞，还会刺激宿主的抗肿瘤免疫反应。因此，人们也将其视为一种癌症免疫疗法。溶瘤病毒感染了肿瘤后产生的免疫反应可以概括为以下几个方面：
首先，病毒对已经在肿瘤内存在的免疫细胞有强烈地刺激作用，能够极大地改变肿瘤的微环境，使之从一个免疫抑制的环境变成免疫激活的状态；
第二，病毒感染的肿瘤细胞能够表达一些所谓的“危险信号”并释放大量的细胞因子，从而造成肿瘤外的免疫细胞对肿瘤内的大量侵润；随后，被激活的非特异性免疫细胞如NK细胞、巨噬细胞等（被病毒吸引来的或原先已经在肿瘤内的）会杀伤和吞噬那些被感染但是尚未裂解或对病毒溶瘤有抵抗的肿瘤细胞，造成除了病毒溶瘤作用之外的第二重细胞杀伤；
第三，被溶瘤病毒裂解的肿瘤细胞释放的大量肿瘤蛋白被侵润的树突细胞和巨噬细胞所吞噬，某些肿瘤特异性抗原可以被这些抗原呈递细胞表达并诱导T细胞攻击未被感染的肿瘤细胞，这一个过程与肿瘤疫苗相似，但因为是发生在肿瘤内，因此是一个所谓的“原位免疫”的过程，其结果是造成特异性免疫细胞如CD8+ T细胞引起的第三重肿瘤杀伤。溶瘤病毒造成的原位免疫是使得免疫细胞攻击远端或者转移肿瘤的主要机制，而且在这个过程中形成的免疫记忆可能使机体产生持久的抗肿瘤疗效。
3最活跃的研发阶段
根据JAMA Oncology上的一篇综述称，目前是溶瘤病毒临床研究最活跃的阶段。有多种多样的病毒已经被作为一种潜在的抗癌疗法，包括疱疹病毒（Herpesvirus）、腺病毒（Adenovirus）、牛痘病毒（Vaccinia Virus）、麻疹病毒（Measles Virus）、柯萨基病毒（Coxsackievirus）、脊髓灰质炎病毒（Polio Virus）、逆转录酶病毒（Retrovirus）、呼吸道肠道病毒（Reovirus）、细小病毒H1（Parvovirus H1）、水疱性口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus）、新城疫病毒（Newcastle Disease Virus）。
在这一综述中，作者们总结了当前临床试验中这些不同溶瘤病毒的一些特点。综述称，根据2016年4月1日在clinicaltrials.gov网站的搜索显示，有约40个用溶瘤病毒治疗癌症的临床试验正在招募患者（详见下表）。这些试验几乎都是在成人患者中进行的。值得一提的是，大多数的试验还是早期的、用于剂量发现的、探索性的研究。
4联合治疗大势所趋
目前的研究结果显示，溶瘤病毒的疗效依然是有限的，但是当其与一种热门的免疫疗法——检查点抑制剂（如PD-1/L1抗体、CTLA-4抗体等）联合时，它的效力能够得到改善。今年3月，发表在Nature Communications杂志上题为“Rational combination of oncolytic vaccinia virus and PD-L1 blockade works synergistically to enhance therapeutic efficacy”的研究再次证实了这一点。
来自匹兹堡大学的科研人员发现，当他们使用牛痘病毒感染癌细胞后，被病毒激活的免疫系统使得更多的T细胞进入了肿瘤组织。面对T细胞的侵入，癌细胞会产生自我保护机制来逃过免疫攻击，其中一种主要办法就是增加PD-L1的表达。科研人员敏锐地意识到，通过这个方法可以将那些原本对PD-1/PD-L1抑制剂不敏感的“冷”肿瘤，变为敏感的“热”肿瘤。这时再加入PD-1/PD-L1抑制剂就有可能取得叠加的效果。
在一个小鼠结肠癌模型中进行的实验证实了这一点：单独使用溶瘤病毒或者PD-L1单抗一周之后，肿瘤的大小减小了一半左右，而两者联用能够使肿瘤减小80%以上，其中超过40%的小鼠体内肿瘤完全消失。此外，两者联用能够延长患癌小鼠的平均生存时间超过一个月。进一步的研究发现，两种疗法联用显着地增加了肿瘤特异的CD4和CD8阳性T细胞的数量，并产生了系统性的针对肿瘤的免疫反应。
基于令人鼓舞的临床前数据，大量的联合治疗临床研究正在进行中。笔者在ClinicalTrials.gov网站最新的搜索结果中看到了很多关于溶瘤病毒联合免疫检查点抑制剂的临床试验。其中，首个获美国FDA批准的溶瘤病毒疗法T-Vec也有很多相关试验正在进行中，包括与PD-1抗体Pembrolizumab联合治疗黑色素瘤、头颈癌、肉瘤，与PD-1抗体 Nivolumab联合治疗淋巴瘤或难治性非黑素瘤皮肤癌等。
5四大独特开发挑战
作为一种新型抗癌疗法，溶瘤病毒的开发有着其独特的挑战。先前，发表在Nature Reviews Drug Discovery上的一篇综述将这些挑战总结为以下几点：1）需要更实用的临床试验设计和终点响应评估标准，2）需要有效的药效动力学和药代动力学（PK/PD）试验，3）存在生物安全问题，4）需要面对非传统的监管、生产和商业化问题。
临床试验设计和响应评估
最近的证据表明，与直接杀死肿瘤细胞相比，免疫介导的抗癌响应可能发生的要慢很多。此外，免疫系统的激活还会导致“假性进展”（pseudoprogression，如，响应可能在肿瘤负担初始增长后或者新病变出现时或出现后才被检测到）。临床试验必须考虑到这些非传统的终点（end point）。它们能够解释为什么会出现延迟的治疗响应。尽管假性进展可能会使临床结果的解释复杂化，但应该被考虑到未来的溶瘤病毒临床试验中。
在临床试验设计方面，受试者的资格、剂量以及体内生物分布评估等也面临着挑战。到目前为止，病毒的剂量通常是基于可能的最大浓度而定的。很少有研究充分探讨了病毒剂量、治疗反应和不良事件发生之间的联系。
对病毒分布的评估实际上是需要评估病毒递送的药效动力学（pharmacodynamics of virus delivery）。理想情况下，这应该包括评估病毒在目标细胞（如癌细胞）中的存在情况、病毒在非目标细胞中的复制情况、潜伏感染的证据、病毒清除、病毒特异性和肿瘤特异性体液和细胞免疫反应（virus-specific and tumour-specific humoral and cellular immune responses）等。虽然许多临床试验在这一方面取得了一些进展，但仍没有形成标准的协定。
药效方面的考虑
溶瘤病毒在很多方面与标准的药物有所不同。首先，它们是活的病毒，临床给药后会在体内增殖，这会导致有效剂量的变化。目前，有关病毒剂量与体内复制潜能以及治疗响应关联的数据很少。因此，临床前研究和临床试验的进一步调查将对建立安全、有效的剂量指南非常重要。
此外，溶瘤病毒会受到宿主抗病毒免疫反应的影响。在这方面，需要考虑的因素很多，包括已存在的中和抗体、病毒特异性记忆T细胞响应、通过血凝素结合使某些病毒失效的潜能以及某些病毒逃避免疫检测的先天能力。另一方面，许多肿瘤微环境是高度免疫抑制的，这可能会限制宿主的免疫反应。因此，开展进一步的研究来评估先前已存在的抗病毒免疫，以及治疗后的免疫响应对更好的理解溶瘤病毒在癌症患者中如何被清除和控制的动力学至关重要。
生物安全性考虑
迄今为止，在许多癌症的临床试验中，溶瘤病毒一直保持着相对可接受的安全性。尽管如此，这些病毒的复制潜能所带来的感染控制问题仍需要被重视。这一综述提出要为卫生保健工作者，尤其是准备这类药物的药剂师以及使用这类药物的医生或护士建立一套指导方针。此外，许多溶瘤病毒包含重组DNA片段，这些DNA片段可能带来的问题也需要被考虑到。
监管和商业化问题
活的溶瘤病毒的复制特性使其拥有了独特的监管和生产问题。对一些病毒来说，它很难产生临床剂量所需的非常高的滴度。这将是生产方面的一大挑战。
病毒疫苗为溶瘤病毒的生产和管理提供了模板。美国FDA已经发布了一个题为“Guidance for Industry： Design and Analysis of Shedding Studies for Virus or Bacteria-Based Gene Therapy and Oncolytic Products”的指导性文件草案。其它一些相关的文件包括“European Directorate for the Quality of Medicines including Cell substrates for the production of vaccines for human use”以及“Tests for extraneous agents in viral vaccines for human use”。这些文件为用于溶瘤病毒生产的所有材料和细胞的质量控制测试提供了指导方针。除此之外，还需要进行中间产物、病毒批次以及最终溶瘤病毒效力的检测。
6广泛应用仍需等待
尽管最新的进展让我们看到了溶瘤病毒成为患者可选择的抗癌疗法的希望，但这类疗法距离真正被广泛使用依然面临着一些需要克服的困难：
第一，由于溶瘤病毒是活的病毒，与所有其它生物或者小分子药物都不同，临床医生需要首先得到充分的训练才会习惯使用这类药物来治疗病人，这将增加此类药物在临床推广的难度。
第二，由于溶瘤病毒目前主要是瘤内注射，对于非体表的肿瘤，操作上不如传统的静脉注射方便。目前也有一些溶瘤病毒试图使用静脉内给药，但是其疗效还待观察。如果临床证明静脉注射的病毒具有同样的疗效，将大大推进该领域的进展。
第三，作为一个完全新型的药物类别，其临床使用方法和疗效的提高还需要时间与经验的积累，尤其是与其它现有药物的最佳联合使用还需要长期的摸索。
7中国科学家成果推荐
提起中国的溶瘤病毒研究进展，想必很多人对M1病毒有一定的印象。2014年10月，中山大学颜光美教授课题组在PNAS杂志发表了关于天然病毒M1具有选择性抗肿瘤作用的研究成果，引发了社会各界的强烈关注。团队在小鼠和人体肿瘤组织上进行的实验显示，M1对肝癌、结直肠癌、膀胱癌细胞的杀伤作用最明显，对黑色素瘤、脑癌和前列腺癌等癌细胞也起作用。
更为关键的是，实验团队找到了M1病毒靶向杀伤癌细胞的特征物———锌指抗病毒蛋白(ZAP)。研究显示，69%肝癌组织、52%结肠癌组织、61%的膀胱癌组织表现出ZAP的低水平。这意味着，若新药成功研发，病人可以先通过检测，确定体内癌细胞缺乏ZAP，便可以进行病毒溶瘤治疗，提高有效的可能性。
此外，研究进行了两种病毒感染正常细胞的实验：一是同一器官的癌细胞和正常组织细胞的对比实验，二是包括心脏、肝、肠管、血管等7种人体主要器官组织的正常细胞感染M1的实验，均未发现M1病毒对正常细胞有损伤作用。
现在，距离关于M1病毒的首篇PNAS论文发表已有两年多的时间。小编整理发现，这期间，颜光美教授课题组已先后在Molecular Therapy、Human Gene Therapy、Oncotarget、PNAS发表了4篇与M1病毒相关的新成果。
研究发现第二线粒体衍生caspase激活因子类似物（second mitochondria-derived activator of caspases (Smac) mimetic compounds， SMCs）能增强M1病毒在难感染肿瘤细胞中的溶瘤效应。细胞和动物实验表明，SMCs和M1病毒的联合能显著杀伤肿瘤细胞并抑制肿瘤生长，正常细胞和组织则不受影响。此外，课题组还使用临床标本离体活组织培养模型进一步证实了上述联合应用的有效性。
8总结
一百多年的尝试和努力使溶瘤病毒这一“老概念”终于有了“新生命”。除了作为单药，溶瘤病毒联合化疗、放疗和其它免疫疗法的组合用药策略也在被进一步研究中。未来，这一领域的挑战将是成功鉴定出对患者最有效的溶瘤病毒疗法，尤其是那些对其它疗法有耐药性的肿瘤患者。我们希望，在科学进步的推动下，溶瘤病毒能够成为挽救患者生命的一种新途径。
原始出处：
Cai J, Lin Y, Zhang H, et al.Selective replication of oncolytic virus M1 results in a bystander killing effect that is potentiated by Smac mimetics.Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Jun 27;114(26):6812-6817. doi: 10.1073/pnas.1701002114. Epub 2017 Jun 12.
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