J Dent Res：颅骨锁骨发育不全患者牙髓细胞分化异常
2015-01-29 MedSci MedSci原创
锁骨颅骨发育不全（CCD）是Runx2基因的杂合突变引起的骨骼发育不良，Runx2基因是骨和牙齿矿化必不可少的。我们从一个十岁的CCD患者中分离出原代牙髓细胞，测试它们的增殖能力、碱性磷酸酶活性、矿化结节的形成能力，并与从7例健康儿童分离出的牙髓细胞对比。测得CCD患者牙髓细胞的各项指标均低于健康对照者。同时我们发现，CCD患者的原代牙髓细胞中，成骨细胞/成牙本质细胞相关基因RUNX2、ALP、O
锁骨颅骨发育不全（CCD）是Runx2基因的杂合突变引起的骨骼发育不良，Runx2基因是骨和牙齿矿化必不可少的。我们从一个十岁的CCD患者中分离出原代牙髓细胞，测试它们的增殖能力、碱性磷酸酶活性、矿化结节的形成能力，并与从7例健康儿童分离出的牙髓细胞对比。测得CCD患者牙髓细胞的各项指标均低于健康对照者。
同时我们发现，CCD患者的原代牙髓细胞中，成骨细胞/成牙本质细胞相关基因RUNX2、ALP、OCN和DSPP 的表达也显著降低。与人外周血单核细胞共同培养的原代牙髓细胞中破骨细胞相关标志物TRAP、CTSK、CTR和MMP9的表达也有降低。此外，CCD患者牙髓细胞中RANKL的表达以及RANKL/OPG 的比例也降低了，这表明RUNX2的突变干扰了骨重建的过程，降低了原代牙髓细胞诱导破骨细胞分化的能力。这可能会造成牙齿发育不全以及乳牙滞留，而牙齿发育不全和乳牙滞留正是CCD典型的临床表现。
讨论
尽管CCD患者中很多存在骨骼缺陷，但是他们最关心的还是牙齿问题，这是降低他们生活质量的首要原因。CCD患者中能够检测到RUNX2基因的杂合突变，进一步证实了RUNX2突变与CCD之间的因果关系(Mundlos et al. 1997)。为了解释CCD患者典型的牙齿异常表现，我们假设，CCD相关基因RUNX2 的突变可能会影响患者原代DPCs的再矿化能力以及诱导破骨细胞分化的能力。
我们发现，RUNX2突变后ALP的活性以及DPCs的矿化能力也降低了。CCD患者原代DPCs的成骨细胞/成牙本质细胞相关基因的表达明显降低，这些基因包括RUNX2、ALP、 OCN、和DSPP。所以，我们可以说原代DPCs的矿化能力由于RUNX2的突变而降低。
我们发现CCD患者的原代DPCs的生长速率较正常对照组慢些。这与先前关于DPCs的研究结果一致 (Xuan et al. 2010)。RUNX2 在骨细胞增殖过程中起着重要的作用 （hinoi et al. 2006）；同时，RUNX2还参与了细胞周期相关基因的表达，例如 TGFB-RII、 VEGFB、和 BMP2 (Ji et al. 2001; Chen et al . 2005)。然而，RUNX2在原代DPCs增殖中的作用仍需进一步的研究。
作为一种转录因子，RUNX2 在骨和牙齿的发育中起着至关重要的作用(Ducy et al. 1997; D’Souza et al. 1999)。许多相关基因都受RUNX2的调控，如OCN、 ALP、 Col I、OPN、BSP、和AMBN(Ducy et al. 1997)。其中，ALP和OCN分别是DPC分化牙本质形成的早期阶段和晚期阶段的标志物。DSPP是成牙本质细胞分化的特异性标志物，并且在小鼠DSPP基因的调控元件中存在着RUNX2 的结合位点(Chen et al. 2002)。
乳牙滞留和恒牙迟萌是CCD患者最常见的口腔表现。乳牙脱落是一个复杂而有序的生理过程，包括成骨细胞/成牙本质细胞和破骨细胞/破牙本质细胞活性之间的平衡。牙周膜细胞和牙囊细胞在这个过程发挥着重要的作用，研究发现原代DPCs也参与了此过程。冠部牙本质在乳牙脱落前才会被吸收 (Sahara et al. 1992)。原代DPCs能够产生细胞因子诱导单核巨噬细胞转变成破骨细胞/破牙本质细胞。乳牙生理性吸收过程中，原代DPCs中RANKL和CSF-1 mRNA的表达会升高(Yildirim et al. 2008)。研究还表明，在人DPCs和人CD14细胞共培养中，会发生破骨细胞自发性诱导分化 (Lossdorfer et al. 2009)。
本研究中，我们评估了RUNX2 突变对原代DPCs诱导破骨细胞分化能力的影响；我们发现当与破骨细胞前体细胞(PBMCs)共同培养时，CCD患者原代DPCs中破骨细胞相关标志物--TRAP、CTSK、 CTR、和 MMP9 —的表达会降低。另一项研究也表明，来自Runx2-/- 小鼠头骨的破骨细胞与正常的小鼠脾细胞一起培养时，成骨细胞诱导破骨细胞分化的能力显著降低(Thirunavukkarasu et al. 2000)。因此，CCD是研究RUNX2突变对骨重建影响的自然模型。
RANKL/RANK/OPG信号通路被认为是调控破骨细胞形成的经典通路。由成骨细胞/基质细胞产生的RANKL和巨噬细胞集落刺激因子刺激破骨细胞前提细胞分化融合，形成功能性破骨细胞(Tanaka et al. 1993)。OPG是RANKL的诱导受体，能够抑制RANKL的功能 (Troen 2003)。 RANKL/OPG的比例在决定成骨细胞和破骨细胞的局部平衡中起着重要的作用(Hofbauer and Schoppet 2004)。我们发现CCD患者原代DPCs中OPG水平升高后，其RANKL mRNA 的水平降低了。因此，RUNX2 突变降低了RANKL/OPG的比例，表明破骨活性的降低和成牙本质细胞/破牙本质细胞的比例失调会影响骨吸收过程。也有研究发现牙周膜细胞以及CCD患者的卵泡细胞中RANKL/OPG的比例相对于正常对照组较低(Lossdorfer et al. 2009; Dorotheou et al. 2013)；Runx2 /-小鼠动物研究发现小鼠颅骨成骨细胞中OPG的表达升高，RANKL的表达降低(Cogulu et al. 2004)，这些研究结果证明了本研究结果的正确性。另一项研究表明RUNX2调控RANKL和OPG的表达以及牙周膜干细胞的破骨细胞诱导能力 (Li et al. 2014)。
然而，关于CCD患者DPCs中RANKL和OPG的局部表达尚未有报道。
总之，我们发现CCD患者原代DPCs表现出增殖、矿化以及支持破骨细胞分化能力的降低。因此我们得出这样的结论:造成这些变化的原因是CCD相关基因RUNX2的突变，同时我们发现，RUNX2的突变会干扰成牙本质细胞的分化和降低原代DPCs诱导前体细胞的骨髓破骨细胞分化的能力。这些结果明确的解释了CCD患者牙体缺损和乳牙滞留的现象。
讨论
尽管CCD患者中很多存在骨骼缺陷，但是他们最关心的还是牙齿问题，这是降低他们生活质量的首要原因。CCD患者中能够检测到RUNX2基因的杂合突变，进一步证实了RUNX2突变与CCD之间的因果关系(Mundlos et al. 1997)。为了解释CCD患者典型的牙齿异常表现，我们假设，CCD相关基因RUNX2 的突变可能会影响患者原代DPCs的再矿化能力以及诱导破骨细胞分化的能力。
我们发现，RUNX2突变后ALP的活性以及DPCs的矿化能力也降低了。CCD患者原代DPCs的成骨细胞/成牙本质细胞相关基因的表达明显降低，这些基因包括RUNX2、ALP、 OCN、和DSPP。所以，我们可以说原代DPCs的矿化能力由于RUNX2的突变而降低。
我们发现CCD患者的原代DPCs的生长速率较正常对照组慢些。这与先前关于DPCs的研究结果一致 (Xuan et al. 2010)。RUNX2 在骨细胞增殖过程中起着重要的作用 （hinoi et al. 2006）；同时，RUNX2还参与了细胞周期相关基因的表达，例如 TGFB-RII、 VEGFB、和 BMP2 (Ji et al. 2001; Chen et al . 2005)。然而，RUNX2在原代DPCs增殖中的作用仍需进一步的研究。
作为一种转录因子，RUNX2 在骨和牙齿的发育中起着至关重要的作用(Ducy et al. 1997; D’Souza et al. 1999)。许多相关基因都受RUNX2的调控，如OCN、 ALP、 Col I、OPN、BSP、和AMBN(Ducy et al. 1997)。其中，ALP和OCN分别是DPC分化牙本质形成的早期阶段和晚期阶段的标志物。DSPP是成牙本质细胞分化的特异性标志物，并且在小鼠DSPP基因的调控元件中存在着RUNX2 的结合位点(Chen et al. 2002)。
因此，本研究探讨了CCD相关基因RUNX2的突变对 ALP、OCN、 DSPP、 和 Col I表达的影响。我们发现ALP蛋白活性和矿化结节形成能力明显降低，而且ALP、OCN和DSPP基因 (mRNA)的表达受到了抑制。令人惊讶的是，RUNX2的突变并没有影响Col I的表达，但这与先前关于小鼠RUNX2基因纯合突变(Runx2-/-) 的研究结果一致 (Aberg et al. 2004)。本研究中，成牙本质细胞中DSPP的表达是降低的，而Col I 的表达却未受到影响。同时，Ding 等人（2013）发现与正常个体相比，CCD患者的牙髓和骨髓中分离出的MSCs的增殖能力和成骨潜能相对正常人较低，这与我们的研究结果一致。这些研究结果表明，RUNX2突变可能降低CCD患者原代DPCs的分化和矿化能力，这可能是CCD患者牙齿异常的原因。
乳牙滞留和恒牙迟萌是CCD患者最常见的口腔表现。乳牙脱落是一个复杂而有序的生理过程，包括成骨细胞/成牙本质细胞和破骨细胞/破牙本质细胞活性之间的平衡。牙周膜细胞和牙囊细胞在这个过程发挥着重要的作用，研究发现原代DPCs也参与了此过程。冠部牙本质在乳牙脱落前才会被吸收 (Sahara et al. 1992)。原代DPCs能够产生细胞因子诱导单核巨噬细胞转变成破骨细胞/破牙本质细胞。乳牙生理性吸收过程中，原代DPCs中RANKL和CSF-1 mRNA的表达会升高(Yildirim et al. 2008)。研究还表明，在人DPCs和人CD14细胞共培养中，会发生破骨细胞自发性诱导分化 (Lossdorfer et al. 2009)。
本研究中，我们评估了RUNX2 突变对原代DPCs诱导破骨细胞分化能力的影响；我们发现当与破骨细胞前体细胞(PBMCs)共同培养时，CCD患者原代DPCs中破骨细胞相关标志物--TRAP、CTSK、 CTR、和 MMP9 —的表达会降低。另一项研究也表明，来自Runx2-/- 小鼠头骨的破骨细胞与正常的小鼠脾细胞一起培养时，成骨细胞诱导破骨细胞分化的能力显著降低(Thirunavukkarasu et al. 2000)。因此，CCD是研究RUNX2突变对骨重建影响的自然模型。
RANKL/RANK/OPG信号通路被认为是调控破骨细胞形成的经典通路。由成骨细胞/基质细胞产生的RANKL和巨噬细胞集落刺激因子刺激破骨细胞前提细胞分化融合，形成功能性破骨细胞(Tanaka et al. 1993)。OPG是RANKL的诱导受体，能够抑制RANKL的功能 (Troen 2003)。 RANKL/OPG的比例在决定成骨细胞和破骨细胞的局部平衡中起着重要的作用(Hofbauer and Schoppet 2004)。我们发现CCD患者原代DPCs中OPG水平升高后，其RANKL mRNA 的水平降低了。因此，RUNX2 突变降低了RANKL/OPG的比例，表明破骨活性的降低和成牙本质细胞/破牙本质细胞的比例失调会影响骨吸收过程。也有研究发现牙周膜细胞以及CCD患者的卵泡细胞中RANKL/OPG的比例相对于正常对照组较低(Lossdorfer et al. 2009; Dorotheou et al. 2013)；Runx2 /-小鼠动物研究发现小鼠颅骨成骨细胞中OPG的表达升高，RANKL的表达降低(Cogulu et al. 2004)，这些研究结果证明了本研究结果的正确性。另一项研究表明RUNX2调控RANKL和OPG的表达以及牙周膜干细胞的破骨细胞诱导能力 (Li et al. 2014)。
然而，关于CCD患者DPCs中RANKL和OPG的局部表达尚未有报道。
总之，我们发现CCD患者原代DPCs表现出增殖、矿化以及支持破骨细胞分化能力的降低。因此我们得出这样的结论:造成这些变化的原因是CCD相关基因RUNX2的突变，同时我们发现，RUNX2的突变会干扰成牙本质细胞的分化和降低原代DPCs诱导前体细胞的骨髓破骨细胞分化的能力。这些结果明确的解释了CCD患者牙体缺损和乳牙滞留的现象。
原始出处：
Yan WJ1, Zhang CY2, Yang X3, Liu ZN4, Wang XZ2, Sun XY2, Wang YX5, Zheng SG6.Abnormal Differentiation of Dental Pulp Cells in Cleidocranial Dysplasia.J Dent Res. 2015 Jan 14. pii: 0022034514566655. [Epub ahead of print]
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