导语
由于目前尚无有效的药物治疗方法，CAVD给临床和经济带来了沉重的负担。
病变纤维层中过多表达的蛋白在功能上被标记为纤维化和钙化途径
从宏观到微观的途径一致，我们接下来假设，与钙化阶段相关的通路与纤维化病变协同出现。由于钙化在纤维层中优先发生，我们在随后的分析中重点关注病变层，并确定了88个显著丰富的(q<0.05)蛋白途径(图3B;图XI;表IV)。在整合素细胞表面相互作用、PI3K(磷脂酰肌醇3-激酶)/Akt信号通路、类维生素A代谢和转运、骨矿化调控等方面观察到显著的通路富集，预示着在CAVD疾病进展中可能的作用。松质层中血液凝固和氧化相关通路的高富集表达表明，这一层在疾病进展中有一种新的主动参与(图3B)。在患病的脑室中，富集分数最高的通路与平滑肌收缩和(心)肌病有关(图3B)。
与钙化期通路网络(图X)相一致，腔隙纤维膜通路网络富集了凝血和补体通路以及脂蛋白和ecm相关通路。此外，PI3K-Akt信号通路、内分泌系统、血小板通路、糖胺聚糖、整合素-通路和胶原相关通路是最显著的子网络(图XII)。
限定微表层VIC迁移蛋白质组——微层特异性蛋白质组保存在VICs中
我们继续从宏观到微观的瓣膜病变观察，接下来我们关注的是VICs，主要的瓣膜细胞类型。目前的模型认为VIC成骨性过渡有助于瓣膜钙化。因为瓣膜钙化是在纤维层开始的，我们假设来自纤维层和心室层的VICs具有不同的表型和不同的钙化潜力。为了验证这一假设，我们用生长方法(图4A)从8个CAVD供体小叶中分离出纤维层和心室层特异性VIC个体，并进行体外钙化试验(图4B)。为了体外模拟瓣膜钙化，我们使用了两种常用的钙化介质条件。在碱性磷酸酶(ALPL)依赖的成骨培养基(OM)和不依赖ALPL的钙化培养基(PM)条件下，由茜素红染色评估的矿化在纤维源性VICs和心室肌VICs(图4B)中都有增强。
图4。从纤维组织和心室肌微层中分离出瓣膜间质细胞(VICs)，形成钙化主动脉瓣疾病(CAVD)。A，层特异性细胞分离:将主动脉瓣瓣标本切成两半，将纤维膜或心室肌侧壁向下放置。VICs迁移并扩展了特定层的文化。B、纤维瘤VICs在成骨(OM, n=7个个体供体)和钙化介质(PM, n=8个供体)中表现出较高的钙化倾向;采用茜素红染色法评价钙化程度，定量评价;* P < 0.05。C、火山图为第0天CAVD VICs蛋白质组学数据。蓝色和红色标记分别表示在脑室肌层和纤维膜中高度表达的层特异性蛋白，折叠变化(FC)截止值为1.5。显著富集(P<0.05)的层特异性蛋白用其名称表示。维恩图显示了组织蛋白组学(空泡层，左边矩形)和VIC蛋白组学(空泡VICs，右边圆形)与纤维肌层(红色)和脑室肌层(蓝色)之间的交集。在每一对集合的交点上显示蛋白质。在成骨和钙化环境中培养的纤维源性维生素a与钙化相关疾病分期的比较。在对照(CM)、成骨(OM)、促进钙化(PM)培养基中培养E、纤维源性VICs, 7天后在相应培养基中采集蛋白样本。F、热图和主成分分析(来自2个独立的供者)在CM、OM和PM中培养7天(q<0.05-过滤数据，以区分介质条件，数据来源于CAVD VICs数据集)。在7天的培养基处理后，vice - pm和vicom蛋白组与整个组织蛋白组的钙化期CAVD蛋白组(n=9)的交集。在交点区域的蛋白质被标记。
我们假设，钙化电位的差异是由纤维层或心室层产生的VIC蛋白组数量差异造成的。我们首先分析了钙化状态基线纤维层或心室层产生的VIC蛋白组(≈2个月、2--3个阶段)。检查他们的差异表达蛋白(图4C)，我们发现12种蛋白在心室层-VIC蛋白组中明显升高。在纤维层中，24个蛋白被过度表达(图4C)。在心室层-VIC蛋白组中，特异蛋白质功能注释有糖酵解、糖元异生和ECM组织，而纤维层-VIC蛋白组则指向线粒体、脂肪酸和酮体相关通路，可能预示纤维层和心室层的不同代谢状态(图XIII)。接下来，我们将每个VIC层来源的所有过表达蛋白(F/V FC<1/1.5)映射到PPI网络上，并按照它们之间的中心性(图XIV和XV)对它们进行排序。这一分析揭示了应力纤维相关蛋白(ARF6)和亲癌基因FYN和GSK3B在纤维层- vics中具有高中心性。EGFR、PRKCA、FN1、RPL21和AKT1在心室- vic PPI网络中投影出最高的中间度中心性。
为了进一步验证细胞蛋白信号，我们比较了纤维肌层和心室肌层源性的VICs与组织蛋白体组(图4D)。7种蛋白在病变的纤维化层和纤维层源性的VICs中均很常见(APOE, ATP1B3, COL4A1, HAPLN1, SDCBP, p4, TNC)。相比之下，心室肌层源性的 vics和心室肌层原生组织层共享14种蛋白质(AHNAK2、CAV1、CIRBP、EFEMP1、FERMT2、FHL1、HIST1H1B、LMNA、LMNB1、NID2、PARVA、SDPR、SORBS3、SRP14)。
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