Cell Rep：张毅组揭示核移植重编程过程中的重要调控规律——李劲松等点评
2018-05-24 赛小记 BioArt
体细胞核移植技术是现今唯一能产生全能性胚胎的技术，也是哺乳动物克隆所使用的主要技术，因此一直备受科学领域和医学界关注。1962，英国科学家John Gurdon首次通过该技术克隆爪蟾胚胎，建立起体细胞重编程研究领域并因此荣获2012年诺贝尔奖。2013年，美国科学家Shoukhrat Mitalipov证明了体细胞核移植技术也能够产生囊胚并用于获取人胚胎干细胞，为核移植技术进入临床，成为治疗手段奠
体细胞核移植技术是现今唯一能产生全能性胚胎的技术，也是哺乳动物克隆所使用的主要技术，因此一直备受科学领域和医学界关注。1962，英国科学家John Gurdon首次通过该技术克隆爪蟾胚胎，建立起体细胞重编程研究领域并因此荣获2012年诺贝尔奖。2013年，美国科学家Shoukhrat Mitalipov证明了体细胞核移植技术也能够产生囊胚并用于获取人胚胎干细胞，为核移植技术进入临床，成为治疗手段奠定了基础。哺乳动物体细胞核移植技术是指将哺乳动物的体细胞移入去核的卵母细胞中，形成核移植胚胎的技术。虽然克隆羊、克隆猴等依赖于体细胞核移植技术的哺乳动物克隆相继实现突破（Cell发布中国克隆猴重大成果，季维智院士、高绍荣教授独家点评），但核移植胚胎和正常体外受精胚胎相比，发育成功率极低。然而，这一过程中体细胞重编程的分子机制仍然鲜为人知。因此，深入研究该过程的分子机制不仅有助于我们了解体细胞重编程过程中的全能性获得，还能提高克隆胚胎发育的成功率，为科研、生产和临床获取足够的克隆来源细胞提供保证。
近些年，在胚胎发育以及诱导胚胎干细胞的重编程过程中的分子机制方面出现了重要的突破性研究。这些研究发现，在染色质层面上的表观遗传调控在配子或者体细胞重编程过程中具有重要作用。同时，哈佛医学院的张毅组和同济大学的高绍荣组都通过对核移植胚胎重编程过程的机制研究，鉴定到了重编程过程中重要的组蛋白修饰壁垒以及X染色体失活的异常，并通过打破这些壁垒显着提高了核移植效率。2012年，哈佛大学Alexander Meissner组发现核移植胚胎中DNA甲基化的擦除不及胚胎中甲基化去除的彻底，但这些保留的DNA甲基化是否是重编程障碍还有待进一步验证。
在体细胞核移植重编程过程中，染色质调控元件的分布可能发生了重要的改变，而这些元件通常被细胞重要转录因子结合，位于开放的染色质区域中。但由于核移植胚胎的稀缺性，体细胞核移植重编程过程中，在全基因组层面上的染色质开放区域的重编程过程仍然是个未解之谜。为了开展这一研究，张毅通过优化的少量细胞染色质开放区域定位技术（liDNase-seq），检测了作为核供体的卵丘细胞和核移植胚胎中的开放染色质区域，鉴定到了可能参与这一过程的重要转录因子，并揭示了核移植胚胎发育过程中开放染色质的调控规律。相关工作以Reprogramming of Chromatin Accessibility in Somatic Cell Nuclear Transfer Is DNA Replication Independent 为题于近日发表在Cell Reports杂志上。
首先，研究揭示，体细胞重编程过程中开放染色质的改变极为迅速，在核移植胚胎激活短短12小时后，其染色质状态就已经和体外受精胚胎的染色质状态相似。由于技术限制，12小时是目前可以获取的核移植胚胎细胞核的最早时期。其次，研究还发现与诱导的多能性干细胞不同，核移植胚胎虽然在12小时后已经经历了一次DNA复制，但其染色质重编程并不依赖于DNA复制（过去有研究表明异核体介导的体细胞重编程过程是依赖于DNA复制的）。最后，研究发现开放染色质的重编程和转录调节因子具有密切关系，并鉴定到了这一过程中可能参与调控的转录因子。
SCNT胚胎在12小时后具有和IVF胚胎相似的开放染色质区域且不依赖复制
该研究首次揭示了哺乳动物体细胞核移植过程中染色质层面上的重编程过程，再一次说明卵母细胞中可能存在某些蛋白能够高效催化细胞核的染色质重塑，完成转录调控的迅速改变（相较于成体细胞而言，卵子的细胞质的体积要大得多，而且包含有大量的转录因子，或许这一点可以解释为什么核移植重编程过程发生得非常迅速而剧烈）。研究中鉴定到的转录因子也为后续的功能研究提供了候选基因。这是继核移植胚胎转录重编程的研究后在机制研究上的又一次突破性进展，这对我们了解体细胞重编程过程的机制，提高体细胞核移植技术都具有重要作用。
专家点评
谢振飞、李劲松（中科院生化细胞所）
克隆胚胎与受精胚胎表观遗传变化的相似性
精子进入卵子后形成受精卵起始一个新的生命，这一过程伴随着剧烈的表观遗传学变化，包括精子遗传物质DNA甲基化的大规模擦除和染色质结构的变化等，说明卵子中蕴含着大量的表观遗传调控因子。2011年徐国良课题组和我们课题组合作发现卵子中的母源因子Tet3蛋白会选择性进入精子遗传物质形成的雄原核中参与了受精后精子基因组上DNA甲基化的大规模主动擦除的过程，同时发现类似的过程也出现在克隆胚胎中来自供体细胞核的假原核；后续的合作研究进一步表明无论是在精子还是在卵子基因组上，都存在不可忽略的Tet3蛋白介导的DNA甲基化的主动擦除过程。
近年来，随着微量测序技术的开发和运用，哺乳动物乃至人的早期胚胎发育过程中的多种表观遗传修饰的动态变化过程正在逐步被阐明。例如2016年同济大学高绍荣实验室、清华大学颉伟实验室及他们的合作课题组同时发表了多篇重量级文章，利用微量chip技术或者是改进建库测序手段，系统性描绘了染色质上组蛋白修饰H3K4me3和H3K27me3在早期胚胎发育过程中的动态变化的图谱，从全基因组水平上揭示了这两种组蛋白修饰的在早期胚胎发育过程中的遗传和重编程的模式。而前不久高绍荣课题组又分析了H3K9me3在早期胚胎发育过程中的变化状况，并揭示了H3K9me3在长末端重复序列异染色质区域的重建对于静息早期胚胎发育过程中活化的转座子元件及异染色质区的形成至关重要。而在关于人类早期胚胎的研究中，研究人员也对合子基因组的DNA甲基化图谱以及部分组蛋白修饰图谱进行了描绘。
利用卵子对体细胞进行重编程的过程类似于精卵融合时的受精过程，剖析核移植过程中体细胞被重编程时的表观遗传变化过程和分子机制对提高克隆效率和进行治疗性克隆的应用具有十分重要的意义。张毅实验室一直从事着表观遗传修饰调控方面最前沿的研究，近年来探讨表观遗传修饰在早期胚胎发育以及核移植重编程的生理过程中的作用做出了非常漂亮的工作，提出了H3K9me3的组蛋白修饰是体细胞核移植重编程过程中的一个巨大屏障，为克隆猴得以成功问世并存活下来扫清了一大障碍；近来他们课题组发现了母本的H3K27me3可以调控一类非经典印记基因的表达。
随着研究技术和手段的革新，对染色质构象和结构的研究也成为表观遗传研究领域另一个重要的分支。如张毅课题组利用low-input DNase I sequencing (liDNase-seq)对着床前小鼠胚胎的DNase I-hypersensitive sites (DHSs)进行了分析，发现受精后的父本基因组的DHSs会快速建立，转录因子Nfya和Oct4对早期胚胎DHSs的建立非常重要。前不久，刘江和陈子江团队合作，利用类似的实验技术，描绘了人类早期胚胎的DHSs动态变化过程。
在最新的这项工作中，研究员人员利用之前开发的liDNase-seq测序技术分析了体细胞核移植重构胚胎激活后12h的体细胞核被重编程过程中的染色质开放程度的变化规律。依据重编程前后供体细胞染色质以及正常受精后的染色质的开放程度，将分析的染色质序列划分为所有情况下都开放的染色质区域（open to open[OO]），仅卵丘细胞开放的区域（open to closed[OC]），仅卵丘细胞重编程前后都开放的区域（resistant to open to closed[rOC]），仅重编程后和体外受精后开放的区域（closed to open[CO]）以及仅体外受精后才开放的区域（resistant to closed to open[rCO]），发现绝大部分的OC和CO区域都远离启动子中心，说明卵子介导体细胞重编程过程中位于基因远端的调控元件被最先重编程，rCO区域具有很高程度的H3K9me3修饰，说明H3K9me3是重编程过程中一个barrier，与之前的研究结果一致。
对这些区域进一步进行转录因子结合模块的分析，发现Fra1和Sox5特异性调控卵丘细胞转录组的转录因子主要富集在OC区域上，而在CO区域上主要富集的是调控发育全能性的转录因子如NFY的结合模块，这表明在卵子介导体细胞重编程过程中，体细胞特异性转录因子可能先从染色质区域解离下来，导致体细胞特有的DHSs减少，染色质被重塑，之后CO区域逐渐建立，与胚胎发育全能性相关的因子开始占据CO位点，开启了合子基因的转录过程。
之后文章还探讨了DNA复制在DHSs重编程过程中的作用，他们在体细胞核移植重构胚胎激活4h时体细胞基因组尚处于G1时期，加入DNA复制的抑制剂Aphidicolin，加药处理8h，让重编程过程中DNA不能复制，之后收样检测体细胞重编程前后DHSs的变化。结果表明不管是否加入了Aphidicolin，重编程过程后的DHSs并没有发生显着性的改变，这表明体细胞重编程过程中，染色质的DHSs的变化是独立于DNA复制的，是一个不依赖于DNA复制的被动重塑DHSs的过程。
这一研究进一步证明，核移植过程中体细胞遗传物质在重构胚胎第一个细胞周期中会发生类似于受精卵雄原核的表观遗传学变化，显示卵子中蕴含的大量RNA和蛋白质对于快速且高质量重编程体细胞起着至关重要的作用。同时，本文中预测出来的一些新的母源因子可能在DHSs的重塑过程中起到重要的作用，接下来找到和验证这些转录因子的作用功能并阐明其分子机制，将会对核移植重编程领域产生巨大的影响，并可能进一步推动治疗性克隆、克隆猴等的应用研究。
原始出处：
Djekidel MN, Inoue A, Matoba S,et al.Reprogramming of Chromatin Accessibility in Somatic Cell Nuclear Transfer Is DNA Replication Independent.Cell Rep. 2018 May 15;23(7):1939-1947. doi: 10.1016/j.celrep.2018.04.036.
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