时隔3年后，韩春雨发布全新科研成果论文
2019-07-19 佚名 生物世界 中国科学报 医谷综合
近日，韩春雨在预印本网站BioRxiv上发表了一篇关于基因编辑的新文章：Background free tracking of single RNA in living cells using catalytically inactive CasE。
时隔3年，曾处于舆论旋涡的韩春雨公开了一项最新研究成果。
近日，韩春雨在预印本网站BioRxiv上发表了一篇关于基因编辑的新文章：Background free tracking of single RNA in living cells using catalytically inactive CasE。
文章共有5名作者，依次为Feng Gao， Yue Sun， Feng Jiang， Xiaoyue Bai， Chunyu Han，工作单位均为河北科技大学基因编辑研究中心。其中，韩春雨为通讯作者。
据了解，论文中提到的CasE是Ⅰ-E型 CRISPR复合物的核心成分，它通过结合特定的茎环区域单独处理pre-crRNA，称之为 CasE Binding S，简称为CBS。CasE保守His20参与催化活性，ΔHis26-TtCse3突变的CasE（dCasE）则失去了催化活性，但仍然与其靶标紧密结合。
在该研究中，通过将 split 荧光与dCasE的N端和C-末端（ΔHis20）融合，构建了活体RNA跟踪工具VN-dCasE-VC。该系统仅在存在靶RNA时才发出荧光，从而增强信噪比。
在活细胞中进行可视化的RNA追踪，不需要特定的亚细胞分布。CasE-GFP和dCasE-GFP在HEK293T细胞中的高水平表达和均匀分布表明CasE和dCasE适合于活细胞中的RNA操作。
为了测试CasE在哺乳动物细胞中表达时是否具有强活性，作者构建了“关闭”报告基因质粒CBS-GFP-N1。它由5′-UTR中的GFP mRNA和CasE结合位点（CBS）组成。当CasE被引入系统时，GFP表达水平急剧下降。
同时，为了进一步测试CasE活性，作者还构建了“开启”报告基因质粒RED-16×CBS-Lin28-C1，其中CBS插入RED单体基因的3′-UTR区和Lin28的上游。Lin28是RNA核保留信号，在其3′-UTR中具有lin28信号的RED单体mRNA几乎不能翻译成蛋白质。
CBS-CasE依赖限制性切断lin28信号并从核释放靶mRNA用于翻译（图1E和图1F）。这些表明CasE可以结合并切割哺乳动物细胞中的CBS。
另外，为了将dCasE-CBS相互作用设计到RNA追踪系统中，作者通过将split-FP5-7与dCasE蛋白结合。发现一个版本，即VN-dCasE-VC很难发出荧光，这可能是由于不正确的折叠或不稳定的状态，但是当与靶RNA（CBS）结合时，可以在荧光显微镜下清楚地捕获荧光信号，即使VN-dCasE-VC表达质粒的转染剂量非常低。
接下来，作者使用VN-dCasE-VC系统追踪哺乳动物细胞中过表达的β-肌动蛋白（β-Actin）的mRNA，VN-dCasE-VC系统在细胞质中显示出强荧光。此外还观察到，向靶mRNA添加更多CBS可改善信号，荧光追踪更清晰，因此，可以通过增加CBS的数量来检测低丰度的mRNA。
总的来说，韩春雨团队发明了一种新的RNA追踪工具，将其命名为VN-dCasE-VC，该系统能够追踪活细胞中没有背景的特定RNA，通过荧光将其可视化。
目前已有两种活细胞RNA追踪成像工具，一种是MS2，一种是Cas13a，韩春雨团队开发的dCasE系统，成像效果由于MS2，而且，dCasE蛋白的分子量为22kDa，远小于Cas13a的130kDa，dCasE的小分子量更容易递送至细胞内，因此更适合用于活细胞的RNA追踪。
一位接近韩春雨的人士透露：“这篇文章是此前韩春雨工作的延续，目的都是开发基因编辑工具。”
不过，值得注意的是，该研究目前发表于预印本网站，尚未经过同行评议，
对此，有科研人士指出，首发在未经同行评议的预印本上，是为了获得首发权。“韩春雨下一步还会投正式期刊的。”前述人士推测。
不知道此次新的研究成果是否会再次给韩春雨带来关注，2016年5月，《自然—生物技术》发表韩春雨团队新的基因编辑技术NgAgo，被媒体以“甘坐冷板凳、十年憋大招”的故事原型炒作而走红，此后半年，韩春雨个人及其所在大学陆续获得各类名誉和大量经费资助，但亦有国内多名基因编辑领域科学家实名发声称实验结果难以重复，怀疑实验结果的真实性。
2017年8月，《自然—生物技术》发表题为《是该数据说话的时候了》社论，宣布撤回韩春雨团队于2016年5月2日发表在该期刊的论文。
2018年9月，河北科技大学发布公告，韩春雨团队不存在主观造假。但依据有关规定，取消韩春雨所获得的荣誉称号，终止韩春雨团队承担的科研项目并收回科研经费。
韩春雨团队回应称，实验设计存在缺陷、研究过程存在着不严谨的问题。
有业界人士表示：“这波之后，NgAgo这个研究方向在中国做得很慢。韩春雨他们的工作开展起来也比较困难，连学生也没有新招。”
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