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从SARS病毒到MERS病毒,将冠状病毒推入聚光灯下

2020/1/26 作者:抗体圈AbC   来源: 抗体圈AbC 我要评论0
Tags: 冠状病毒  SARS  

1.简介

在首次发生严重急性呼吸道综合症(SARS)之前,已知数量有限的冠状病毒在人体内传播,仅引起轻度疾病,例如普通感冒[1]。在2003年SARS大流行之后[2,3],冠状病毒显然可以越过物种壁垒并导致威胁人类生命的感染

21世纪见证了以前无法识别的两种冠状病毒在世界范围内传播,且具有高致病性,它们分别是严重的急性呼吸综合症冠状病毒(SARS-CoV)[4]和中东呼吸综合症冠状病毒(MERS-CoV)。中国从2002年11月开始[5],SARS冠状病毒在人与人之间出现了前所未有的传播,并伴随着高死亡率。在全球范围内的共同努力下使得SARS冠状病毒得以快速鉴定,并且在流行病预防方面短时间内有了显着的科学进步。此外,2003年12月至2004年1月SARS的人畜共患病传播[6]为研究人员深入了解这种新型冠状病毒的起源提供了线。值得注意的是,2004年SARS大流行宣布结束,当时没有再检测到患者感染。随后,在蝙蝠体内发现的某些疑似 SARS-Cov病毒显示出在没有预先适应的情况下感染人类细胞的能力[7,8],这表明 SARS-Cov 或 类似SARS-Cov病毒有可能再次出现。10年后的2012年6月,在沙特阿拉伯,从一名死于急性肺炎和肾衰竭的男病人的痰液中分离出另一种高致病性新型冠状病毒MERS-CoV[9]。医院感染被报道,国际旅行导致MERS-CoV病毒传播到阿拉伯半岛以外的国家,使其成为全球性的病原体。2015年5月,韩国爆发中东呼吸综合症,原因是一个人从中东返回[10]。根据过去十年来管理 SARS流行的经验教训,在揭示MERS的生物学特性方面取得了前所未有的巨大进展。科学的进步使我们在理解 MERS-CoV病的流行病学和发病机理方面取得了迅速和系统的进展。

    SARS-CoV和MERS-CoV具有几个重要的共同特征,下呼吸道的优先病毒复制和病毒免疫病理学,这些特征促成医院内传播。这篇综述重点介绍这些病毒的流行病学和致病机理,包括我们目前对它们的生物学特性、传播及在宿主体内的复制的了解。Covs的S蛋白在病毒感染和致病过程中起着关键作用。作为Covs关键的表面三聚体糖蛋白,由它们引导进入宿主细胞。本文综述了S蛋白的结构和功能以及靶向S蛋白的治疗方法。此外,我们将探讨冠状病毒与宿主之间的相互作用如何导致致病性结果,讨论潜在的治疗方案,并描述与致病过程密切相关为SARS-CoV和MERS-CoV的预防和治疗策略的发展做出贡献的最新哺乳动物模型。尽管已在动物和体外模型中确定了SARS和MERS的几种潜在疗法,但仍缺乏人体临床试验,这阻碍了这些潜在对策的进展。

2.SARS-CoV和MERS-CoV的流行病学

   在SARS和MERS暴发之前[2,9],研究人员已经认识到冠状病毒的临床重要性和流行可能性(表1)。2002年,起源于中国广东省的SARS流行病使29个国家的8098例患者中的916人死亡[11],从而将SARS确认为21世纪的第一种新型传染病。十年后,世界卫生组织(WHO)发布了2012年至2018年9月16日发生的2254例经实验室确认的MERS-CoV病例,在27个国家中至少有800例死亡。值得注意的是,最近对这种感染的病毒学和遗传学的研究中,有80%以上表明蝙蝠可能是SARS和MERS-CoV的天然宿主。在传播给人类之前,棕榈[12]和单峰骆驼[13]也可能分别是SARS和MERS的中间宿主。

SARS-CoV和MERS-CoV的传播机制尚未完全了解。对于从动物到人类的传播,与中间宿主直接接触可能是一种途径。最近的报道表明,沙特阿拉伯骆驼工人的MERS-CoV感染率很高,可能有助于MERS的传播[15]一些风俗习惯也可能有利于传播,如食用牛奶、尿液或生肉。通过这种方式,MERS-CoV由单峰骆驼直接传播给人类,主要是在阿拉伯半岛,这被认为是从动物传播给人类的主要途径,造成了严重的发病率和死亡率[16,17]。还发现了人与人之间的传播,特别是通过医院传播。医院诊断的延迟可能导致医护人员,家庭成员或其他患者共享房间时发生继发病例[18-22]。在报告的SARS病例中,中国有22%是医护人员,而加拿大则有40%以上是医护人员[23]。中东[16]和韩国[22]同样发现中东呼吸综合症的院内传播。其他国家的疫情都是由中东或北非报告的病例引起的,而传播则是国际旅行的结果。SARS和MERS均引起了大规模暴发,给公众健康和经济造成了重大影响。

表1.严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的流行病学和生物学特征

3.SARS-CoV和MERS-CoV的发病机制

尽管我们目前对SARS-CoV和MERS-Co感染的发病机理的了解仍不清楚,我们对目前已知的情况进行了总结(表2)。

表2. SARS-CoV和MERS-CoV的基因组表征

冠状病毒是最大的一种正链RNA病毒(26–32 kb),它们的直径约为125 nm [24],并且包括四个属(α,β,γ和δ型冠状病毒)[25]。目前,已经确认了六种人类冠状病毒(HCoV):HCoV-NL63和HCoV-229E,它们属于α-冠状病毒属。HCoV-OC43,HCoV-HKU1,SARS-CoV和MERS-CoV属于β冠状病毒属。SARS-CoV和MERS-CoV是引起人类严重肺炎的两个主要原因,它们具有一些冠状病毒共同的结构特征。 同样,它们的基因组结构是典型的冠状病毒,具有一个包膜的单正链RNA基因组,该基因组编码四种主要的病毒结构蛋白,即表面刺突糖蛋白(S),外膜蛋白(E),外膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)3–5,它们遵循特征基因顺序[5’端重复(rep基因),刺突(S),包膜(E),膜(M),核衣壳(N)-30]在两个末端都具有短的非翻译区(图1)。病毒膜包含S,E和M蛋白,而刺突蛋白在病毒进入中起着至关重要的功能作用。rep基因编码非结构蛋白,在50末端约占基因组的三分之二。详细地讲,S蛋白负责受体结合和随后的病毒进入宿主细胞,因此是主要的治疗靶点[26,27]。M和E蛋白在病毒装配中起重要作用,而N蛋白是RNA合成所必需的。

SARS-CoV基因组的长度为29,727个核苷酸,包括11个开放阅读框(ORF)。SARS-CoV rep基因约占基因组的三分之二,编码至少两种多蛋白(由ORF1a和ORF1b编码),这些蛋白经过共翻译蛋白水解过程。在第2组的ORF1b和S与某些第3组的冠状病毒之间,存在一个编码血凝素酯酶的基因[4],而在SARS-CoV中未检测到。由于许多原因,该病毒与以前报道的冠状病毒明显不同,例如S蛋白的短锚点,小ORF的特定数量和位置以及仅存在一个PLPpro拷贝。

MERS-CoV基因组比SARS-CoV基因组长30,119个核苷酸,由5’端帽状结构和3’末端的 poly (A)尾, 基因组5’端有16个非结构蛋白(nsp1-16)组成。四个结构蛋白(S,E,M和N)和五个辅助蛋白(ORF3,ORF4a,ORF4b,ORF5和ORF8)在基因组的3’端构成约10 kb序列。与其他一些β-冠状病毒不同,MERS-CoV基因组不编码血凝素酯酶(HE)蛋白[1]。MERS-CoV的基因组分析表明,在MERS-CoV暴发期间可能发生基因重组[9]。MERS-CoV和SARS-CoV分别具有5和8个辅助蛋白,它们可能通过对先天免疫应答有害而帮助病毒逃避免疫系统。这些差异可能导致对MERS-CoV中1型干扰素(IFN)的诱导和信号传导作用的敏感性高于SARS-CoV。

图1. SARS-CoV和MERS-CoV的S蛋白的基因组结构和功能域的示意图

SARS-CoV和MERS-CoV的单链RNA基因组编码两个大基因,ORF1a和ORF1b基因,它们编码16个非结构蛋白(nsp1-nsp16),在整个冠状病毒中高度保守。结构基因编码结构蛋白,表面刺突糖蛋白(S),外膜蛋白(E),外膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N),这是所有冠状病毒的共同特征。辅助基因(绿色阴影)在数量、基因组结构、序列和功能方面对不同冠状病毒是独特的。每个S蛋白的结构显示在基因组结构下方。S蛋白主要包含S1和S2亚基。  每个区域中的残基编号分别表示它们在SARS和MERS的S蛋白中的位置。S1/ S2裂解位点用虚线突出显示。SARS-CoV,严重急性呼吸系统综合症冠状病毒;MERS-CoV,中东呼吸综合征冠状病毒;CP,胞质结构域;FP,融合肽;HR,七肽重复;RBD,受体结合域。

4. SARS-CoV和MERS-CoV的病理学和生命周期的比较

SARS和MERS都由这些新型冠状病毒引起严重的肺炎,其发病机理具有相似性(图2)。SARS是一种新兴的传染性病毒病,其特征在于下呼吸道的严重临床表现,导致弥漫性肺泡损伤。SARS-CoV通过人与人直接接触通过呼吸道分泌物(例如飞沫)传播。 宿主暴露于病毒后,病毒会与表达病毒受体的细胞结合,其中血管紧张素转化酶2(ACE2)是主要受体之一,而CD209L是具有较低亲和力的另一种受体[29 ] 在呼吸道中,ACE2在肺泡,气管,支气管,支气管浆液性腺[30],肺泡单核细胞和巨噬细胞[31]的上皮细胞中广泛表达。病毒进入炎性趋化因子和细胞因子[35]。病毒进入并在这些靶细胞中复制。 然后,成熟的病毒体从原代细胞中释放出来并感染新的靶细胞[32]。 此外,作为表面分子,ACE2还扩散地位于动脉和静脉的内皮细胞,肠的粘膜细胞,肾脏的肾小管上皮细胞,肾小管的上皮细胞以及脑神经元和免疫细胞上各种对SARS-CoV敏感的细胞[33,34]。SARS患者的呼吸道分泌物,尿液,粪便和汗液中含有感染性病毒颗粒,这些颗粒可能会排泄到环境中并污染环境。SARS-CoV感染可引起非典型肺炎,并伴有快速呼吸恶化和衰竭,这是由于活化的促炎性趋化因子和细胞因子水平升高所致[35]

图2.宿主细胞中SARS-CoV和MERS-CoV的生命周期

SARS-CoV和MERS-CoV通过体运输途径进入靶细胞。SARS和MERS的S蛋白分别与细胞受体血管紧张素转换酶2(ACE2)和细胞受体二肽基肽酶4(DPP4)结合。病毒进入宿主细胞后,病毒RNA在细胞质中暴露出来。翻译ORF1a和ORF1ab产生pp1a和pp1ab多蛋白,它们被ORF1a编码的蛋白酶切割,产生16个非结构蛋白,形成RNA复制酶-转录酶复合物。这种复合物通过复制和转录来驱动负义RNA [(-)RNA]的产生。复制期间,将产生基因组的全长(-)RNA副本,并将其用作全长(+)RNA基因组的模板。在转录过程中,通过不连续转录产生7-9个亚基因组RNA的子集,包括编码所有结构蛋白的RNA。尽管不同的亚基因组mRNA可能包含几个开放阅读框(ORF),但仅翻译第一个ORF(最接近5’端的ORF)。病毒核衣壳由细胞质中的基因组RNA和N蛋白组装而成,进入ERGIC(内质网(ER)-高尔基体中间区室)内腔。然后通过胞吐作用将病毒颗粒从被感染的细胞中释放出来。SARS-CoV,严重急性呼吸系统综合症冠状病毒;MERS-CoV,中东呼吸综合征冠状病毒;S,表面刺突糖蛋白;E,外膜蛋白;M:外膜蛋白;N,核衣壳蛋白。

对于人类的MERS-CoV感染,主要受体是多功能细胞表面蛋白二肽基肽酶4(DPP4,也称为CD26)[36],该蛋白广泛表达在肾脏,肺泡,小肠,肝脏和前列腺中的上皮细胞中,以及在激活的白细胞中[37]。与此相符的是,MERS-CoV可以感染多种人类细胞系,包括下呼吸道,肾脏,肠和肝细胞以及组织细胞,正如细胞系易感性研究[38]所显示的那样,这表明 MERS-CoV病毒在体外的组织嗜性范围比任何其他 CoV病毒更广。Mers-CoV可引起急性、高度致命的肺炎和肾功能不全,有多种临床症状,包括但不限于发烧、咳嗽、喉咙痛、肌肉痛、胸痛、腹泻、呕吐和腹痛[39,40]。肺部感染MERS动物模型显示中性粒细胞和巨噬细胞浸润和肺泡水肿[41]。MERS-CoV的进入受体(DPP4)在肾脏中也高度表达,通过缺氧性损伤或直接感染上皮引起肾功能不全[42]。值得注意的是,与SARS-CoV不同,MERS-CoV具有在体外感染人树突状细胞[43]和巨噬细胞[44]的能力,从而帮助病毒破坏免疫系统。T细胞由于其大量的CD26而成为MERS -CoV的另一个靶标[45]。由于刺激T细胞凋亡,该病毒可能会解除抗病毒T细胞反应的调控[45,46]。MERS-CoV也可能通过刺激减弱的先天免疫反应而导致免疫失调[47],并在体内外产生延迟的促炎性细胞因子诱导[44,48,49]

5. SARS和MERS-CoV 表面刺突糖蛋白:抗病毒药物的主要靶标

5.1. SARS-CoV和MERS-CoV表面刺突糖蛋白的结构

S蛋白的三聚体组成SARS-CoV的表面刺突蛋白,并形成了1255个氨基酸长的表面糖蛋白前体。大多数蛋白质和氨基末端位于病毒颗粒或细胞表面的外部[50]。S蛋白的预期结构包括四个部分:位于N端的1至12位氨基酸信号肽,13至1195位氨基酸的细胞外结构域,1196至1215位氨基酸的跨膜结构域和1216至1255位氨基酸的细胞内结构域。蛋白酶如Xa因子,胰蛋白酶和组织蛋白酶L的蛋白酶将SARS-CoV S蛋白裂解为两个亚基,即S1和S2亚基。位于S1亚基(氨基酸318-510)中的最小受体结合域(RBD)可以与宿主细胞受体ACE2结合。RBD在与受体相互作用期间显示出凹面。整个受体结合环,称为受体结合体(RBM)(氨基酸424–494)位于RBD上,负责与ACE2完全接触 。重要的是,RBM中第479位和第487位的两个残基决定了SARS疾病的进展和SARS-CoV的向性[51,52]。最近关于小动物,小鼠和大鼠的研究表明,这两个残基的任何变化都可能改善动物对人或人与人之间的传播,并促进有效的跨物种感染[53]。S2亚基介导SARS-CoV与靶细胞之间的融合,并包括七肽重复1(HR1)和HR2域,其HR1区比HR2区长。与SARS-CoV相似,在感染过程中,MERS-CoV的S蛋白被切割成受体结合亚基S1和膜融合亚基S2 [54-57]。MERS-CoV S1亚基还包括RBD,介导病毒与靶细胞之间的附着[54,55,58,59]。与SARS-CoV不同,MERS-CoV需要DPP4(也称为CD26)作为其细胞受体[60,61],但不需要ACE2。MERS-CoV和SARS-CoV的RBD不同,尽管它们在其核心子结构域中具有高度的结构相似性,这解释了上述不同的关键受体[57,62]。RBD的核心子结构域由三个二硫键稳定,并包括一个五链反平行β-折叠和几个连接螺旋。RBM包含一个四链反平行β折叠,用于通过回路连接到核心[57,62]。两个N-连接的聚糖N410和N487分别位于核心和RBM中。特别是,RBM的484-567位残基负责与DPP4的细胞外β-螺旋结构域相互作用。MERS-CoV的融合核心形成与SARS-CoV相似。但是,它不同于其他冠状病毒,例如小鼠肝炎病毒(MHV)和HCoV-NL63 [63-66]。

5.2.SARS-CoV和MERS-CoV表面刺突糖蛋白的功能

SARS-CoV S蛋白在病毒感染和发病机理中起关键作用[67,68]。S1亚基识别并结合宿主受体,随后S2亚基的构象变化介导病毒包膜和宿主细胞膜之间的融合[69,70]。S1亚基中的RBD负责病毒与宿主细胞受体的结合[61,70,71]。ACE2是SARS-CoV的功能性受体,它与SARS-CoV的RBD中的18个残基中的14个氨基酸接触[53]。S1亚基中的RBD负责病毒与宿主细胞受体的结合[61,70,71]。RBD中的R453位置和ACE2中的K341位置在复合物形成中起着不可或缺的作用[72]。此外,S蛋白 RBD 中的 N479和 T487是与ACE2[52]亲和力的枢纽位点,RBD中的R441和D454影响RBD和ACE2[73]的抗原结构和结合活性。从融合前结构到融合后结构,S1亚基中的RBD与受体ACE2的结合会刺激S2的构象变化。 因此,假定的融合肽(氨基酸770–788)[74]建立在宿主的靶细胞膜中。同时,由HR1和HR2结构域组成六螺旋束融合核心结构,使病毒包膜和靶细胞膜紧密接近并有助于融合[74]

5.3. 基于SARS-CoV和MERS-CoV S蛋白的疫苗

为了控制病毒的爆发,已经针对SARS-CoV和MERS-CoV进行了疫苗接种。 不同疫苗有多种方法,表3列出了这些疫苗的开发方案和优缺点(该表包括2013年以来关于SARS-CoV和MERS-CoV的更新;非典冠状病毒相关部分由 Graham 等人在2013年《自然微生物学评论》中进行了修改。重要的是,在SARS-CoV和MERS-CoV的所有功能/非功能结构蛋白中,S蛋白是主要的抗原成分,可诱导抗体阻断病毒结合,刺激宿主免疫反应,融合或中和抗体和/或保护免疫系统免受病毒感染。因此,已经选择了S蛋白作为开发疫苗的重要靶标。已经注意到,针对S1亚基(氨基酸485–625)或S2(氨基酸1029–1192)的抗体可中和Vero E6细胞中SARS-CoV株的感染[78,79]。研究人员已经构建了一种减毒副流感病毒,该病毒编码SARS-CoV Urbani株的全长S蛋白,用于接种非洲绿猴。该疫苗可以保护猴子免于随后的同源SARS-CoV感染,证明了S蛋白的高效免疫作用[80]。小鼠模型中的其他研究构建了一种编码SARS-CoV Urbani株全长S蛋白的DNA疫苗,该疫苗不仅诱导T细胞和中和抗体反应,而且还刺激了保护性免疫[81]。 此外,给猴子或小鼠接种高度减毒的改良疫苗病毒安卡拉,该病毒编码SARS-CoV株HKU39849或Urbani的全长S蛋白[82]。但是,基于全长S蛋白的SARS疫苗可能会引起有害的免疫反应,从而在接种的动物中受到同源SARS-CoV攻击后引起肝脏损害或增强感染[83,84]。因此,研究人员担心包括全长SARS-CoV S蛋白的疫苗的安全性和最终保护功效。

表3. SARS-CoV和MERS-CoV的疫苗策略

仍然没有针对MERS-CoV的商业疫苗[26]。 已经开发出多种靶向S蛋白的候选疫苗,该蛋白负责病毒的进入,包括亚单位疫苗[85,86],重组载体疫苗[87,88]和DNA疫苗[89,90]。 重要的是,与S蛋白的其他区域相比,RBD片段在小鼠中诱导了最高滴度的IgG抗体[85]。改良的疫苗,包括安卡拉和表达MERS-CoV S糖蛋白的腺病毒的重组载体,在小鼠中显示出免疫原性[25]。减毒活疫苗也显示出保护功能,但对减毒程度存在担忧[91]。 经鼻内接种CoV N蛋白后,产生气道记忆CD4 T细胞并在CoV攻击后介导保护作用[92]。这些细胞可以在感染的早期诱导抗病毒的先天应答,并通过刺激重组树突状细胞迁移和CD8 T细胞动员促进CD8 T细胞应答[92]。刺激气道记忆CD4 T细胞应被视为任何HCoV疫苗策略的重要组成部分,因为这些CD4 T细胞靶向与其他几种CoV交叉反应的N蛋白内的保守表位[92]。此外,表达MERS-CoV S1基因的DNA疫苗在小鼠中产生了抗原特异性的体液和细胞免疫反应[89]

5.4基于蛋白质的SARS-CoV和MERS-CoV治疗方法

尽管存在有关SARS-CoV和MERS-CoV疗法的广泛研究报告,但尚无法确定治疗在患者暴发期间是否使患者受益。在缺乏针对SARS-CoV和MERS-CoV的基本的,临床证明的有效抗病毒治疗的情况下,患者主要接受辅助治疗,并辅以多种药物组合。有几种方法正在被考虑用来治疗SARS-CoV [113]和MERS-CoV(表4,以前由De Wit等在Nature Reviews Microbiology,2016 [10]中审查过的与MERS-CoV相关的表),包括抗体,IFN,病毒和宿主蛋白酶抑制剂的使用。SARS-CoV的S蛋白的至关重要的作用使该蛋白成为重要的治疗靶标,许多研究已经探索了潜在的治疗方法。首先,可将源自RBD [114]和ACE2 [76]的阻断RBD-ACE2结合的开发为抗SARS-CoV感染的新型疗法。其次,与S蛋白结合的肽干扰S1和S2的切割。该步骤抑制了功能性S1和S2亚基的产生以及随后的病毒包膜与宿主细胞膜的融合。第三,通过形成融合活性核心来阻止HR1-HR2相互作用的抗SARS-CoV肽在微摩尔水平上具有病毒融合抑制活[115-117]。然而,宿主范围表型改变的逃逸突变体的潜在选择是这种策略的缺点之一,需要进一步修改[118]。此外,针对SARS-CoV S蛋白各种片段的小鼠单克隆抗体(mAb)有效抑制了SARS-CoV感染[79,119-122]。从感染SARS-CoV的患者的B细胞中产生了一系列中和性人单克隆抗体[123,124]。另一种策略是使用经全长SARS-CoV S蛋白免疫的人免疫球蛋白转基因小鼠[125-127]。与ACE2受体结合的80R和CR3014是S特异性mAb的例子[128,129]。类似地,已经针对MERS-CoV开发基于S蛋白的治疗剂,并且基本上抑制了受体的结合或膜蛋白的融合,从而导致对 MERS-CoV感染的抑制。这些方法主要涉及肽类融合抑制剂[56,63,116,130],抗MERS-CoV中和单克隆抗体[86,131],抗DPP4单克隆抗体[86,132,133],DPP4拮抗剂[134]和蛋白酶抑制剂[135-137]。但是,这些抗MERS-CoV治愈剂均未获准用于人类商业用途。

表4.重症急性呼吸综合征(SARS)和MERS的潜在疗法

6. SARS和MERS-CoV的动物模型

通过国际协调与合作,迅速查明了非典型肺炎和中东呼吸综合症。紧急控制措施和实验室检测系统在应对SARS和MERS疫情时都起到了示范作用。 为了建立针对非典和中东呼吸综合症的最佳预防和控制策略,多个实验室进行了大量的建立动物模型的努力,尽管事实上报道了一些相互矛盾的结果。因此,有必要比较和记录不同动物模型的特点和缺点,以便更好地了解病毒的复制、传播、发病机制、预防和治疗。值得注意的是,有几种动物被建议作为 SARS-Cov合适的疾病模型,但大多数实验室动物对 MERS-Cov感染是难以控制的或只是半许可的。

6.1.SARS冠状病毒的动物模型

已在小鼠,叙利亚金毛和中国仓鼠,猫鼬和非人类灵长类动物中研究了SARS-CoV。在老年动物中观察到SARS最严重的症状。为了发展高龄导致死亡率增加的流行病学症状,已经建立了SARS-CoV的老年小鼠模型。表达人ACE2的转基因小鼠也可以紧密模拟人类的SARS-CoV感染。已经在基因组和蛋白质组学水平上对一些动物模型进行了测试和分析,以研究SARS的发病机理。

6.1.1.小鼠模型

用作SARS-CoV感染动物模型的小鼠包括BALB/c[149,150],C57BL6(B6)[151]和129SvEv谱系小鼠。根据这些易感动物,可获得最相关的转基因和基因敲除品系[152]。信号转导和转录激活因子1(STAT1)敲除和髓样分化初级反应88(MYD88)敲除小鼠[149,151,153,154]是先天性免疫缺陷小鼠模型的例子,此类动物表现出严重的疾病影响,例如肺炎,细支气管炎和体重减轻,通常在感染后9天内死亡。值得注意的是,与衰老小鼠相比,年轻小鼠需要更多的突变和传代才能产生SARS-CoV小鼠适应株。一岁大的动物中观察到更严重的病理损害和更高的死亡率,并且在整个基因组的其他位置的突变也更少[98,155-159]。4-8周龄 BALB / c或B 6小鼠经鼻接种 SARS-CoV后,上呼吸道出现鼻甲化,下呼吸道出现高滴度病毒复制,该模型重复性好,无任何发病或死亡迹象[149,151]。受到亚致死性感染的小鼠可能产生中和抗体反应,以保护接受者免受随后的致命挑战,这可能反映了疫情期间受感染人类的情况[160]。但是,在感染后的第2-3天(pi),病毒在呼吸道中的复制达到峰值,但并未伴有大量的肺部炎症或肺炎。 到感染后第5-7天,该病毒已经从肺中消除[149,151]。很明显,病毒血症是常见的且长期存在的患者,而在小鼠模型中则很少见且短暂[161]。因此,可以将小鼠用作稳定且可复制的动物模型,用于评估疫苗,免疫预防和抗病毒药物抗SARS冠状病毒的药[81,96,109,124,149,162-166]

6.1.2.仓鼠模型

金色叙利亚仓鼠和中国仓鼠也被评估为优秀的严重急性呼吸综合症模型,因为它们在呼吸道中的病毒复制滴度高,与弥漫性肺泡损伤、间质性肺病和肺实变有关[104,167-169].在感染后第2天,在下呼吸道检测到病毒复制的最高水平,并且在感染后7-10天清除了病毒,没有明显的临床疾病。与小鼠相似,被感染的仓鼠也对随后的SARS-CoV攻击产生保护性中和抗体反应[104,170]。由于SARS病毒感染的仓鼠有极高的效价和可重复的肺部病理损伤,这种动物模型是研究SARS免疫预防和治疗的理想模型[104,170]。 然而,在建立动物基因系和仓鼠模型的精确免疫和细胞生物标志物方面,仍然存在有限的资源。

6.1.3.雪貂模型

    雪貂被发现对严重急性唿吸综合症敏感,但也可以通过直接接触在低水平上传播病毒。他们在不同的研究中显示出不同的临床症状[171,174]。重要的是,雪貂可能会发烧,这是SARS冠状病毒感染患者的典型临床症状[93,175]。与啮齿动物模型相似,SARS-CoV感染雪貂不会导致明显的死亡率。 然而,关于雪貂模型的组织病理学损伤和临床观察的严重性仍有一些相互矛盾的报道,需要进一步的研究。

6.1.4.非人类灵长类动物模型

    评价了几种非人类灵长类动物(NHP)作为SARS的动物模型。至少有六种NHP物种被测试,其中包括三种旧大陆的猴子: 恒河猴[176-180]、食蟹猴[177,181,182]和非洲绿猴[177] ; 以及三种新大陆的猴子: 普通的狨猴[183]、松鼠猴和野野绢毛猴[176-178,181-184]。阐明了SARS-CoV的复制[186]。在猕猴,食蟹猕猴和非洲绿猴的呼吸道中检测到病毒复制。在不同的研究中,在每个物种中均观察到了肺炎[176-178,182]。感染非典型肺炎的普通狨猴表现为发热、水样腹泻、肺炎和肝炎。不幸的是,对食蟹猴和恒河猴疾病临床症状的研究结果相互矛盾,因此需要进一步的研究。这类研究缺乏可重复性的主要原因可能是样本数量有限。

6.2.MERS-CoV的动物模型

迫切需要MERS感染的小型动物模型,以阐明MERS的发病机理并探索潜在的疫苗和抗病毒药物。以前的研究已经证明了开发这样一个模型的困难,例如小鼠[187,188] ,雪貂[134],豚鼠[189]和仓鼠[189]不易受实验性MERS-CoV感染,主要是因为它们的同源 dpp4分子不能作为MERS-CoV进入的受体。给予高剂量的MERS-CoV后,在这些动物中未检测到病毒复制[190]。 在使用新西兰白兔的动物模型中,无论在呼吸道中是否存在可检测的病毒RNA以及在鼻甲中观察到中度坏死的事实,这些动物均未显示疾病的临床症状[191]。在另一项研究中,用MERS-CoV感染仓鼠的尝试未成功[192]。 然而,尽管如此,MERS-CoV是一种广泛的体外宿主病毒[25],并希望在不久的将来能改善可复制和稳定的人类MERS-CoV感染动物模型。6.2.1.MERS感染的小鼠模型

尽管野生型啮齿动物对MERS-CoV感染不敏感[188],但研究人员已经开发了几种小鼠对MERS-CoV感染易感的模型[193-195]。2014年报道的首个MERS感染小鼠模型涉及通过鼻内编码人类DPP4(hDPP4)分子的重组腺病毒5转导动物,这使得MERS-CoV在肺中复制。这种小鼠模型还显示出间质性肺炎的临床症状,包括炎性细胞浸润,肺泡增厚和轻度水肿[195]。但是,这个模型有一定的局限性,例如 hdpp4的不受控制的表达和分布。2015年,报道了 hdpp4转基因小鼠的建立[194]。MERS-CoV可以有效感染这种小鼠模型。但是,类似于SARS-CoV感染的ACE2转基因小鼠[196],系统性表达导致多器官损伤[194],最终导致动物死亡。最近,同源的hDPP4基因被用于几种MERS转基因小鼠模型中[193,197]。值得注意的是,hDPP4敲入(KI)小鼠显示出有效的受体结合,其中小鼠DPP4基因片段已被同源的人DPP4片段置换。 此外,经过30次连续传代后,hDPP4-KI小鼠的肺中产生了包含13–22个突变的小鼠适应性MERS-CoV株(MERSMA),在该小鼠模型中引起有效的体重减轻和死亡率[193]。这种 hdpp4-ki 小鼠和 mersma 菌株为探索 mers 的发病机制和新的治疗方法提供了更好的工具。

6.2.2.骆驼科

作为MERS-CoV的储存库,单峰骆驼在感染MERS-CoV后显示出轻度的上呼吸道感染[198]。驼科家族近亲羊驼中的MERS-CoV口鼻感染导致无症状感染,没有上呼吸道疾病或下呼吸道疾病的迹象[199,200]。 另外,由于它们的高成本和相对较大的尺寸,这些动物模型不可用于MERS的高通量研究。

6.2.3.非人类灵长类

   NHP,例如恒河猴[201]和普通狨猴[202],是用于研究轻度MERS-CoV感染的发病机理并评估人类新疗法的有用模型,尽管其复制程度和疾病严重程度有所不同[192,201,203,204]。MERS-CoV引起恒河猴的短暂下呼吸道感染,并伴有肺炎。 在感染后第1天观察到临床体征,最早在感染后第4天即可解决[201]。在感染初期观察到相对轻微的临床症状,但没有死亡,这表明恒河猴不能重现在人类病例中观察到的严重感染,然而,用IFN-α和利巴韦林治疗感染恒河猴减少病毒复制,减轻宿主反应,改善临床结果[205]。普通狨猴的MERS-CoV感染根据研究显示出不同程度的损害,但成功地复制了人类 MERS-CoV感染的若干特征。重要的是,一项研究表明,这种感染变成了进行性的重症肺炎[203] ,而其他群体发现,MERS-CoV患者只通过气管内注射发展成轻度至中度的非致命性呼吸系统疾病[206]

7.  宿主受体在SARS-CoV和MERS-CoV动物模型中的作用

各种动物模型均未观察到或仅观察到有限的临床症状,其原因是复杂的。SARS和MERS的宿主受体和功能蛋白之间的相互作用,分别起着重要和显著的作用。 在严重急性呼吸综合症动物模型的背景下,研究人员比较了几个物种与S蛋白 RBD 相互作用的 ACE2氨基酸。与这些物种的许可性质一致,狨猴和仓鼠的 ace2残基类似于 hace2[53]。相比之下,小鼠ACE2的许多残基与hACE2的残基不同,这与SARS-CoV在小鼠细胞[207]和年轻小鼠的肺部[149]中的复制减少有关。大鼠ACE2相对于hACE2的位置353(组氨酸)82(天冬酰胺)的变化部分破坏了S蛋白-DPP4的相互作用并有助于取消绑定。 有趣的是,雪貂允许SARS-CoV感染,但它们的大多数ACE2相互作用残基与hACE2的残基不同[53],而在麝香和雪貂之间的许多ACE2残基相同,可能导致相似的亲和力[208]。对于MERS-CoV,S蛋白RBD的14个残基与hDPP4的15个残基直接接触[57]。人DPP4与其他物种的结合亲和力的比较表明,人DPP4对MERS-CoV的S蛋白具有最高的亲和力,其亲和力递减顺序如下:人>马>骆驼>山羊>蝙蝠[209]。进一步的证据表明,宿主对MERS-CoV的限制明显取决于DPP4的序列,例如在小鼠[187,210]、仓鼠和棉鼠[210]中,DPP4连接处氨基酸残基的角色塑造和 s 蛋白的 RBD。然而,恒河猴和普通狨猴之间疾病严重程度的多样性表明,其他宿主因素可能会影响病毒的感染和复制,例如存在S裂解蛋白酶[187]。一般来说,虽然受体-s 蛋白质相互作用的结构分析不能完全解释宿主限制的所有观察结果,但他们同意在一些动物模型中改进的复制,这应该是小动物模型发展的首要和显著的重点。这些对宿主亲和力的特殊残基对于建立增强SARS和MERS的允许性和感染性的转基因动物模型很重要。

8.  展望与总结

SARS冠状病毒的持续爆发对公共卫生构成了持续威胁,与 SARS 冠状病毒不同的是,MERS没有更多的报告病例。应当指出的是,目前尚无针对HCoV的特异性治疗方法,因此有必要进一步研究HCoV感染的发病机理,以鉴定合适的治疗靶标。因此,目前,防止病毒传播对于限制MERS的传播至关重要。医院感染的比例很高,表明医院的预防措施尚未得到充分实施。另外,作为新兴的人畜共患病毒,防止单峰骆驼传播是减少MERS病例数量的另一种可能性。在临床治疗方面,由于弥漫性肺损伤的急性临床特征和免疫病理学的重要作用,最适合的治疗方法可能是尽早实施联合治疗,以同步干扰病毒复制、抑制病毒传播和抑制宿主反应。潜在的治疗方法必须进行体外和体内研究,以选择最有希望的方向。因此,稳定,可再现的MERS动物模型(特别是在NHP中)的开发是向前迈出的决定性一步。 研发标准化和可控制的抗非典和中东呼吸综合症治疗方法的下一步将是人体临床试验,验证剂量和时间的标准方案,并在未来疫情爆发期间实时积累数据,以监测具体的不良影响并为治疗提供信息。SARS和MERS爆发带来的全面教训和经验为如何应对未来的新兴市场和新兴市场提供了宝贵的见识和进步。传染媒介。第一步是通过有效的诊断分析快速识别病原体,然后实施预防措施,包括提高对新药的认识,报告和记录(疑似)病例,以及医疗机构的感染控制管理。 当前需要研究集中在这些生物的流行病学上,特别是在病原体传播和潜在的水库和/或中间宿主。 应提倡动物模型以及预防和治疗方法,然后进行快速的临床试验。我们对新出现的冠状病毒的日益了解将伴随着合理设计治疗药物的机会增加。 重要的是,了解这些基本信息不仅有助于我们应对SARS-CoV和MERS-CoV的公共卫生准备工作,而且还有助于为可能出现的新型冠状病毒做准备。

原文来源:

Z Song et al.From SARS to MERS, Thrusting Coronaviruses Into the Spotlight. Viruses 11 (1). 



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