Science：再次颠覆教科书观点--PKA全酶发挥蛋白激酶活性不需要调节亚基解离
2017-06-30 佚名 免疫细胞研究bioworld
教科书就是拿来推翻的，最新的SCIENCE发表的关于PKA结构的文章（1）再次推翻了教科书中关于PKA结构的描述。在教材第六版《细胞的分子生物学》（Molecular Biology of the Cell， 6th）的图15-26中明确说明，PKA全酶是一个由两个催化亚基（C）和两个调节亚基（R）组成的，cAMP与调节亚基结合后，调节亚基离开催化亚基，解放后者蛋白激酶活性。然而在最新的研究文章中
教科书就是拿来推翻的，最新的SCIENCE发表的关于PKA结构的文章（1）再次推翻了教科书中关于PKA结构的描述。在教材第六版《细胞的分子生物学》（Molecular Biology of the Cell， 6th）的图15-26中明确说明，PKA全酶是一个由两个催化亚基（C）和两个调节亚基（R）组成的，cAMP与调节亚基结合后，调节亚基离开催化亚基，解放后者蛋白激酶活性。然而在最新的研究文章中发现在生理浓度cAMP作用下，PKA发挥催化活性不需要调节亚基与催化亚基解离。
新文首先用了单粒子电镜（Single-particle electron microscopy）技术观察到PKA锚定蛋白AKAP （A kinase anchoring protein）存在下，AKAP和PKA全酶五聚体（AKAP，两个催化亚基，两个调节亚基）形成的三叶状结构（图2）。锚定蛋白AKAP为一叶，两个催化亚基形成另外两叶，两叶之间的距离从紧凑型的150 到舒张型的250。五聚体的结构还可以通过非变性质谱（Native Mass Spectrometry）和pull-down方法观察到。更重要的是在cAMP与调节亚基结合情况下，仍可以显着地观察到催化亚基与调节亚基结合在一起（> 50%），而不是传统概念中的两者解离。最后在细胞内，利用免疫共沉淀、荧光共振能量转移（FRET）和临近连接技术（proximity ligation assay， PLA）观察到在β肾上腺素受体信号作用下PKA发生活化，但没有发生明显的PKA全酶解离。新文用详尽的蛋白与蛋白相互作用的研究证明细胞内PKA活化，PKA全酶不发生传统认为的解离。
为了进一步证明不解离的PKA全酶具有蛋白激酶活性，研究者非常巧妙地把PKA的调节亚基与催化亚基融合表达，使之共价连接不能发生解离。在PKA调节亚基（PRKAR2A，PRKAR2B），催化亚基（PRKACA）三基因敲除的细胞中表达融合的PKA能够正常发挥PKA激酶活性。另外，利用雷帕霉素作用下，FRB结构域能够与FK506结合结构域（FKBP）结合的特性，FRB结构域融合的PKA催化亚基和FKBP结构域融合的调节亚基在雷帕霉素作用下可以形成稳定复合物。甚至在高于生理浓度的cAMP作用下（加cAMP水解酶抑制剂），雷帕霉素仍能锁定PKA的催化亚基与调节亚基，而这一复合物具有PKA催化活性。这两实验非常明确地说明了PKA调节亚基与催化亚基的解离不是其发挥催化活性所必需。
新文让读者眼睛一亮的同时，也引起我们的思考。1，新文的想法可能源于AKAP的性质，AKAP能够与PKA的调节亚基结合，多数也能与PKA底物结合，形成信号微域（signaling microdomain）。cAMP与调节亚基结合，使催化亚基磷酸化底物，因此与底物一起结合AKAP的调节亚基解离（推开）催化亚基可能不符合信号微域的作用。2，要想打破传统的观念并不容易，新文基本上穷尽了研究蛋白蛋白相互作用的方法，还引入了相对较新的单粒子电镜技术。3，新文也留下了进一步研究方向，那就是cAMP作用下PKA全酶不解离，那在结构上发生了什么样的变化使之获得活性？在单粒子电镜下观察到多种全酶的结构，如果这些异质性结构是生理性的，又具有什么样的功能？
【作者简介】
John D Scott 博士 （http：//faculty.washington.edu/scottjdw/）
Scott博士是华盛顿大学医学院教授，HHMI研究员。其实验室专注研究PKA锚定蛋白APAK赋予PKA信号的时空特异性。从1985在PNAS上发表关于PKA的抑制性作用蛋白开始，1991发表第一篇通讯作者的文章，发现PKA锚定蛋白上的两亲螺旋与PKA调节亚基相互作用，一直到最新的打破教科书的新发现，30多年来一直围绕PKA开展研究。
原始出处：
Smith, F. D., et al.Local protein kinase A action proceeds through intact holoenzymes.Science. 2017 Jun 23;356(6344):1288-1293. doi: 10.1126/science.aaj1669.
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