Science：奠基人Doudna揭示了碱基编辑器的分子作用机制

CRISPR-Cas指导的碱基编辑器将细胞DNA中的AT转换为GC，或将CG转换为TA，以进行精确的基因组编辑。在体外，ABE8e的脱氨DNA速率分别比ABE7.10和miniABEmax高590倍和1170倍。相对于WT TadA，ABE7.10和ABE8e在其进化的TadA域内分别包含14和22个氨基酸取代。这些突变如何使进化的TadA催化DNA脱氨，以及ABE7.10和ABE8e不同催化速率的分子基础仍然未知。

2020年7月31日，美国加州大学伯克利分校Jennifer A. Doudna团队（与David Liu团队合作）在Science 在线发表题为“DNA capture by a CRISPR-Cas9–guided adenine base editor”的研究论文，该研究确定了ABE8e的3.2埃分辨率冷冻电子显微镜结构，其底物结合状态下脱氨酶结构域与CRISPR-Cas9中暴露的DNA结合 R环复合体。 动力学和结构数据表明，ABE8e催化DNA脱氨的速度比最初的ABE版本快约1100倍，这是因为突变使DNA底物以受限的tRNA样构象稳定。 此外，ABE8e的加速DNA脱氨反应表明，以前从未观察到的瞬时DNA退火可能在CRISPR-Cas9进行双链DNA监测期间发生。 这些结果解释了ABE8e介导的碱基编辑结果，并为碱基编辑器的未来设计提供了依据。

另外，2020年7月16日，美国加州大学伯克利分校Jennifer A. Doudna团队在Science在线发表题为“CRISPR-CasΦ from huge phages is a hypercompact genome editor”的研究论文，该研究描述了一个功能最小的CRISPR-Cas系统，包括单个？70Kd蛋白CasΦ和一个CRISPR阵列，其仅在巨大噬菌体的基因组中编码。CasΦ使用单个活性位点进行CRISPR RNA（crRNA）加工和crRNA指导的DNA切割，以靶向外来核酸。该超紧凑型系统在体外以及在人和植物细胞中均具有活性，相对于其他CRISPR-Cas蛋白，其靶标识别能力得到了扩展。CasΦ可用于基因组编辑和DNA检测，但分子量仅为Cas9和Cas12a基因组编辑酶的一半，为细胞传递提供了优势，从而扩展了基因组编辑工具箱。

基因组DNA中靶向核苷酸的编辑是研究和治疗应用的一项关键功能。单核苷酸变体（SNV）约占已知致病等位基因的一半，因此有针对性的点突变可以促进遗传病的研究或潜在治疗。以前，研究人员开发了胞嘧啶碱基编辑器（CBE）和腺嘌呤碱基编辑器（ABE），它们共同实现了所有四个过渡点突变的靶向（C→T，T→C，A→G ，以及G→A），并具有较高的期望取代率与不期望的插入和缺失（indels）比率。

基因组DNA中AT到GC碱基对和CG到TA碱基对的位点特异性转化可以纠正人类中所有已知的致病性单核苷酸多态性（SNP）的60％。可以使用CRISPR-Cas9碱基编辑器，RNA引导的Cas蛋白与单链DNA（ssDNA）脱氨酶融合来实现这种转化。DNA中从A？T到G？C的转变需要将腺苷脱氨为肌苷，这被细胞机制识别为鸟苷。由于没有能够将DNA中的腺嘌呤脱氨的酶，大肠杆菌tRNA腺苷脱氨酶（TadA）与Cas9融合并进化为ABE7.10，可催化脱氧腺苷的目标脱氨。

ABE7.10编码两个拷贝的TadA，即与进化的TadA（TadA-7.10）相连的N端野生型（WT）TadA，其在C端与“切口酶”相连。此后，ABE7.10被广泛用作在许多细胞类型和生物中基因组DNA脱氨的工具。发现ABE7.10变体可催化细胞中的脱靶RNA编辑，其活性因TadA-7.10结构域的突变或通过去除N末端WT TadA结构域而降低，从而生成了截短的miniABEmax。

ABE7.10进一步进化为ABE8e，该ABE8e编码与8个经过测试的Cas效应子广泛兼容的单个TadA域（TadA-8e）。在体外，ABE8e的脱氨DNA速率分别比ABE7.10和miniABEmax高590倍和1170倍。相对于WT TadA，ABE7.10和ABE8e在其进化的TadA域内分别包含14和22个氨基酸取代。这些突变如何使进化的TadA催化DNA脱氨，以及ABE7.10和ABE8e不同催化速率的分子基础仍然未知。

该研究确定了ABE8e的3.2埃分辨率冷冻电子显微镜结构，其底物结合状态下脱氨酶结构域与CRISPR-Cas9中暴露的DNA结合 R环复合体。动力学和结构数据表明，ABE8e催化DNA脱氨的速度比最初的ABE版本快约1100倍，这是因为突变使DNA底物以受限的tRNA样构象稳定。此外，ABE8e的加速DNA脱氨反应表明，以前从未观察到的瞬时DNA退火可能在CRISPR-Cas9进行双链DNA监测期间发生。这些结果解释了ABE8e介导的碱基编辑结果，并为碱基编辑器的未来设计提供了依据。

原始出处：

Audrone Lapinaite,Gavin J. Knott,Cody M. Palumbo, et al.DNA capture by a CRISPR-Cas9–guided adenine base editor.Science 31 Jul 2020:Vol. 369, Issue 6503, pp. 566-571DOI: 10.1126/science.abb1390