Nature Immunol：发明基于CRISPR的集成内源基因激活肿瘤免疫疗法
2019-10-16 BioArt BioArt
癌症免疫疗法，特别是靶向T细胞表面分子的免疫检查点疗法，在临床癌症治疗中取得了巨大的成功 ，给此前近乎无药可用的晚期癌症病人带来曙光。目前，免疫疗法在过二十种癌症中获批，成为转移性肺癌等几种癌症的一线标准疗法。为此，免疫检查点疗法的开创者James P. Allison和Tasuku Honjo获得2018年诺贝尔生理医学奖。目前主要的免疫疗法包括免疫检查点疗法、细胞疗法、非特异性免疫疗法（如细胞
癌症免疫疗法，特别是靶向T细胞表面分子的免疫检查点疗法，在临床癌症治疗中取得了巨大的成功 ，给此前近乎无药可用的晚期癌症病人带来曙光。目前，免疫疗法在过二十种癌症中获批，成为转移性肺癌等几种癌症的一线标准疗法。为此，免疫检查点疗法的开创者James P. Allison和Tasuku Honjo获得2018年诺贝尔生理医学奖。目前主要的免疫疗法包括免疫检查点疗法、细胞疗法、非特异性免疫疗法（如细胞因子等）、癌症疫苗和溶瘤病毒。然而，现有的免疫治疗方法对大部分的癌症患者病并没有明显的疗效。因此，开发新型免疫疗法以及拓展免疫疗法的适用人群对肿瘤医学有至关重要的意义。
2019年10月15日，耶鲁大学陈斯迪（Sidi Chen）课题组在Nature Immunology杂志上以长文（Article）的形式发表了文章 Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPRa elicits potent antitumor immunity 。在这项工作中，陈斯迪团队发明了集成内源基因激活疗法 （MAEGI， Multiplex Activation of Endogenous Genes as Immunotherapy），集成内源基因激活疗法(MAEGI)是完全不同于上述主要五种现有疗法的一种基于CRISPR基因表达调控的新型肿瘤免疫疗法，技术上是一种基因治疗手段，效果上是多重体内免疫调控。
在抗肿瘤免疫反应中，免疫系统对肿瘤抗原的特异性识别和杀伤是决定免疫治疗成败的关键。然而不幸的是，在癌症发展恶化过程中，肿瘤细胞经常下调甚至完全沉默某些抗原的呈递来逃逸免疫系统对其的识别和杀伤。更为不幸的是，抑制性肿瘤免疫微环境会进一步提高免疫杀伤的阈值，损害免疫系统对肿瘤的识别和攻击。特异性提高肿瘤细胞表面的抗原呈递和免疫刺激信号表达，有望改善免疫系统对肿瘤的识别和杀伤，使肿瘤-免疫之间天平倾向于免疫清除。
陈斯迪课题组的王广川和Ryan Chow等人利用CRISPR激活（CRISPRa）系统的可编程性和简易的高度集成性 (Multiplex)，使用将不具有核酸酶活性的Cas9 (dCas9) 与转录激活因子融合，由导向RNA (single-guide RNA，sgRNA) 引导到靶基因的位置，实现了体内多重特异激活细胞中靶向基因的表达。与传统方法相比， CRISPRa系统的优势是可以同时高通量地激活多个指定的目标基因的表达。
研究者在本项目中发现CRISPRa能增强靶基因中相关抗原的表达和呈递，来诱导更强的免疫识别和杀伤。研究者在实验中发现CRISPRa激活的肿瘤细胞更容易被机体免疫系统清除。例如全基因组激活处理的肿瘤在80%以上的小鼠体内被完全清除。这种现象吸引了他们的兴趣，他们在随后的实验中发现这种CRISPRa激活引起的肿瘤清除是获得性免疫介导的，因为激活处理的肿瘤细胞在免疫缺陷小鼠或T细胞被清除的小鼠中能够迅速生长。这就为集成内援基因激活疗法/MAEGI的概念奠定了基础。
为了解决MAEGI治疗的药物投递，研究者使用了腺相关病毒（AAV）。AAV被广泛应用于基因治疗临床与研究中，是一种良好又相对安全的基因载体。为了实现精准集成内援基因激活疗法（p-MAEGI），他们通过全外显子测序，找出一个三阴性乳腺癌细胞系的所有突变基因，并且设计了靶向改肿瘤但是不靶向正常乳腺组织的精准激活库（p-MAEGI CRISPRa library）。通过瘤内注射腺相关病毒（AAV）的方式来递送精准激活库，靶向激活所有可以产生肿瘤新抗原的突变基因，取得了良好的治疗效果 （如图），接近半数的原位瘤产生完全/近完全应答，超过一半的非直接注射的同体非原位瘤产生完全/近完全应答 （可检测程度上的治愈）。值得一提的是，此策略治愈的小鼠三个月后仍然可以完全清除同种肿瘤的攻击，表明此策略刺激机体产生抗肿瘤免疫具有长效的记忆性。
他们进一步利用流式细胞分析技术和单细胞测序技术对肿瘤微环境中的免疫细胞群进行分析。结果显示CRISPRa激活抗原呈递后能显着增强肿瘤微环境中的免疫浸润，特别是CD4 T细胞、CD8 T细胞和抗原呈递细胞。通过免疫半点杂交技术，他们发现绝大部分肿瘤浸润的免疫细胞是肿瘤抗原特异性的。以上结果表明CRISPRa激活肿瘤抗原表达后，能显着增强肿瘤抗原特异性免疫细胞的杀伤和浸润。这种原位激活肿瘤基因表达的策略，在三阴乳腺癌、黑色素瘤和胰腺癌等三种小鼠肿瘤模型中取得良好的治疗效果。
综上所述，本文描述了陈斯迪课题组发明的集成内源基因激活疗法/MAEGI。内源基因激活的意义是直接介导强烈的抗肿瘤免疫反应，因为目前的新抗原（neoantigen）癌症疫苗疗法通过投递外源多肽或者mRNA只能靶向有限的基因和突变。集成的意义在于灵活精准靶向多个基因甚至整个癌症基因组，因为靶向单基因或者少数几个基因的疗法通常不是非常有效果。这种新疗法通过CRISPRa基因激活实现，不伤害DNA/基因组，只是临时增强特定基因表达使得免疫系统更好的识别并清楚癌细胞。因为MAEGI的全新作用机制，使得它独立于已有的绝大部分治疗手段。因此，MAEGI理论上能与标准疗法或者其他免疫疗法结合，比如和免疫检查点治疗联合应用。对于该疗法临床转化应用，未来的研究和发展急需解决一系列问题，包括CRISPRa系统的有效体内递送，载体和CRISPRa本身的免疫原性，精准靶向库的生产合成质控，药物动力学，毒理学，和在免疫系统差异颇大的不同物种间的激活多基因的安全性验证。集成内源基因激活疗法/MAEGI作为一个全新治疗方式，在未来的发展，转化和完善后，有望应用于多种癌症和其他多基因疾病。
该研究通讯作者为耶鲁大学Sidi Chen (陈斯迪) 教授。第一作者为本实验室博士后王广川和医学双博士（MD-PhD）学生Ryan Chow（周子崴）。
原始出处:
Guangchuan Wang, Ryan D. Chow, Zhigang Bai,et al.Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPRa elicits potent antitumor immunity.Nature Immunology (2019) | Download Citation Published: 14 October 2019
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