Cell丨王艳丽/章新政合作组揭示CRISPR-Csm分子机制—专家点评
2018-12-01 小白薯 BioArt
CRISPR-Cas是细菌或古菌中RNA指导的适应性免疫系统，可保护大多数古细菌和大约一半的细菌免受外来核酸的侵害。CRISPR反应通常分为三个不同阶段：适应，CRISPR RNA（crRNA）生物发生和干扰阶段。在干扰阶段，crRNA和特异性Cas蛋白形成效应复合物。参与CRISPR干扰的Cas蛋白非常多，主要可分为两大类：class 1和class 2。1类系统主要使用多种Cas蛋白复合物来降
CRISPR-Cas是细菌或古菌中RNA指导的适应性免疫系统，可保护大多数古细菌和大约一半的细菌免受外来核酸的侵害。CRISPR反应通常分为三个不同阶段：适应，CRISPR RNA（crRNA）生物发生和干扰阶段。在干扰阶段，crRNA和特异性Cas蛋白形成效应复合物。参与CRISPR干扰的Cas蛋白非常多，主要可分为两大类：class 1和class 2。1类系统主要使用多种Cas蛋白复合物来降解外来核酸，分为I，III和IV亚型。2类系统主要使用单个大型Cas蛋白作为效应复合物，分为II，V和VI亚型。
Csm是一种III-A 型CRISPR-Cas干扰复合物，是CRISPR RNA（crRNA）引导的RNA核酸酶，同时其还具有RNA依赖的DNase和环状寡腺苷酸（cyclic oligoadenylate，cOA）合成酶活性。然而，对于目标RNA结合依赖性的DNA酶切活性的激活和cOA产生的分子机理，此前尚不清楚。
11月29日，中科院生物物理所王艳丽研究组和章新政研究组合作在Cell上发表了题为Structure Studies of the CRISPR-Csm Complex Reveal Mechanism of Co-transcriptional Interference的研究论文，通过X-ray晶体学和Cryo-EM手段解析了来自嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus，Sth）Csm与crRNA复合物、以及同源或非同源靶RNA结合的Csm复合物的结构。该结构为研究crRNA介导的序列特异性RNA切割，RNA靶标依赖的非特异性DNA切割和cOA生成所需的机制过程提供了重要的理论模型和见解。
III型CRISPR-Cas系统的特征在于存在Cas10蛋白，并且细分为四种（III A-D）亚型。 III-A和III-D型系统包含Csm效应复合物，其由五种不同的Csm蛋白（Csm1-Csm5）和crRNA组成。III-B和III-C型系统包含Cmr效应子复合物，其由六个不同的亚基（Cmr1-Cmr6）和crRNA组成。Csm和Cmr复合物中的Cas10蛋白也分别被称为Csm1和Cmr2。 Csm和Cmr复合物中的crRNA在其5′末端具有源自CRISPR重复序列的8个核苷酸（称为5′标签），并且在引导序列（guide sequence）中具有源自CRISPR阵列间隔区的30-45个核苷酸。
III型CRISPR-Cas系统采用独特的靶RNA依赖性机制来保护宿主免受入侵核酸的侵害。crRNA引导的复合物识别互补目标RNA并通过Csm3/Cmr4亚基对它们进行切割。而且，crRNA依赖性靶RNA结合也会激活Csm1/Cmr2 HD结构域对非特异性单链DNA的切割，以及Csm1/Cmr2 Palm结构域对cOA的产生。DNA切割和cOA合成的激活需要crRNA的5′标签序列和靶序列侧翼的3′序列，并且需要他们是非互补但是同源的。相反，如果这些序列是互补的（非同源的），则这两种活性都会被抑制，其原因可能是为了防止反义CRISPR阵列转录物的识别，并避免自身免疫应答。
先前的结构研究揭示了Csm和Cmr复合物的整体结构。然而，crRNA指导的靶RNA切割，靶RNA结合依赖的非特异性单链DNA切割和cOA产生的确切分子机制仍然未知。
为了理解Csm结构如何决定其功能的分子基础，作者从含有嗜热链球菌重复序列-间隔重复阵列的大肠杆菌细胞中提取纯化出重组SthCsm复合物，该阵列具有单个间隔区；同时过量表达纯化SthCsm1-SthCsm5和SthCas6蛋白（图1A）并解析了该Csm蛋白复合物2.9 ？的晶体结构（图1B）。该结构包含了9个亚基和一条crRNA，组成的分子比例是Csm1122334151。该复合物呈现蠕虫状特征，其中三个Csm3和两个Csm2亚基的中心双螺旋核心在一端被Csm1-Csm4亚复合物封闭，在另一端由Csm5亚基封闭。
为了研究crRNA是如何识别靶RNA的分子机理，作者解析了与非同源靶RNA（non-cognate target RNA，NTR）结合的Csm复合物3.16 ？ 的cryo-EM结构，其与crRNA完全互补（图2A）。该复合物含有Csm3 D33N突变体以及Csm1 D16N的突变，以防止靶RNA切割。从结构看，引导靶RNA采用不连续的螺旋结构（图2B），两个Csm2亚基和Csm1D4结构域形成靶RNA的带正电荷的结合表面。在间隔区中，具有crRNA的靶RNA bps形成crRNA-靶RNA双链体。通过堆积相互作用和RNA磷酸基团与Csm亚基之间形成的氢键稳定crRNA靶RNA双链体。
Csm复合物结合靶RNA后会经历一些构象变化。为了分析靶RNA结合后Csm复合物的重排，作者比对了Csm二元和CTR二元和CTR三元Csm复合物结构的Csm3和crRNA。 作者发现两个Csm2亚基旋转远离Csm3亚基，而Csm1向crRNA的5′端旋转，产生一个更宽的足以容纳crRNA-靶双链RNA的结合通道（图2D）。这种类似的构象变化在I-E型级联复合物和III-B型Cmr复合物结合靶标时也能观察到。
为了研究同源靶RNA如何触发ssDNA切割的分子机制，作者解析了3.9 ？的分辨率与CTR1（cognate target RNA）结合的Csm3-D33N和Csm1-D16N的Cryo-EM结构，其是缺乏RNase和DNase活性Csm效应物的双突变体。同样，作者尝试确定了与同源靶RNA（称为CTR2）复合的Csm3-D33N，Csm1-H15A双突变体的Cryo-EM结构，以及分别是3.5 ？和3.05 ？分辨率，结合ssDNA和bubbled DNA（图3）的复合物结构。这三个CTR结合的Csm复合物具有相似的结构。但不幸的是，尽管制备样品中存在DNA，但结构解析时未能在这些复合物中鉴定出清晰的DNA电子密度图。
为了理解保守的Palm结构域是如何结合ATP并将其转化为cOA的，作者分析了ATP或AMPPNP结合的Csm-CTR复合物结构。两个AMPPNP或ATP分子结合在由Palm1和Palm2结构域形成的裂缝中（图4A和4B）。ATP或AMPPNP的位置显示ATP1的3′-OH在结构上准备好对ATP2的α-磷酸基团发起亲核攻击，以形成5′-3′磷酸二酯键。有趣的是，在ATP或AMPPNP存在下，Csm4氨基酸82-104（品红色）形成一个α-螺旋和loop环（图4C），在Palm结构域的ATP结合口袋上方形成盖状结构。相反，在没有ATP的情况下，这些残基似乎在靶RNA结合的Csm复合物中是无序的。这些结果表明，该Csm4区域的灵活性使得ATP结合口袋在没有ATP的情况下保持开放，并且在ATP结合时关闭口袋。此外，AMPPNP2或ATP2结合还可以触发Palm2结构域内GGDD基序的构象变化。
总结一下，先前的研究表明，只有III型CRISPR-Cas系统含有crRNA效应子，其具有三种完全不同的酶活性：靶RNA切割，ssDNA切割和cOA合成。重要的是，RNA依赖性非特异性DNA切割和cOA合成受crRNA的5′标签和靶RNA的3′抗标签之间的互补性控制。
在这里，作者的研究报道了III-A型效应复合物SthCsm的高分辨率晶体结构，以及与不同类型的目的RNA及ATP的七种不同底物结合状态的、近原子分辨率的冷冻电镜结构。研究表明Csm复合物由Csm1-5五种蛋白亚基和一条crRNA共同组成，并发现Csm复合物的组成将随着crRNA的长度变化而发生变化，但是5种Csm蛋白的组成遵循Csm112n3n+14151的规律。该研究选取了3′互补以及非互补的目的RNA，发现目的RNA与crRNA在(-2)-(-5)位是否互补配对是激活Csm1 切割ssDNA以及合成cOA的关键因素。而且，研究发现3′非互补的目的RNA的结合导致Csm1局部区域的构象变化，从而通过别构效应激活Csm1的DNA酶和腺苷酸环化酶的活性。
该研究是CRISPR-Cas系统抗病毒机理的又一重要工作，进一步阐明多蛋白组成的效应复合物识别和切割外源核酸的分子机制，并为开发III型CRISPR系统作为应用工具打下重要的理论基础。
据悉，中国科学院生物物理所王艳丽研究员和章新政研究员为该文的共同通讯作者。王艳丽组的尤李兰（博士生）、王久宇（副研究员）及章新政组的马军（副研究员）为本文的共同第一作者。
专家点评
01江涛（中科院生物物理研究所研究员，前不久在Cell Research发表过相关工作：Cell Res丨江涛/王祥喜合作团队解析III-A型CRISPR-Cas效应复合物的原子分辨率电镜结构）
CRISPR-Cas系统是原核生物中的由RNA介导的获得性免疫系统， 目前被广泛用于基因组编辑。 CRISPR系统分为两大类。第一大类的效应复合物由多种蛋白亚基所组成，结构组成复杂。第二大类的效应复合物为单亚基蛋白，如人们熟知的 Cas9蛋白质就属于第二大类。近年来针对Cas9的研究广泛而深入，目前其已经被改造成为最为成熟的基因编辑工具。值得注意的是，第一大类CRISPR系统同样是国际关注的前沿研究热点，尽管由于该类效应系统是多亚基复合物，使得其在基因编辑方面看起来不如第二大类便利，但是它们有自己独特的优势，包括它们分布最广，在CRISPR系统中占到约90%，具有很强的代表性，具有成为新型基因编辑工具的潜力。
王艳丽团队这次报道的III-A型效应复合物就属于第二大类的CRISPR系统。 由于该系统的复杂性以及缺乏高分辨率结构， 所以对于III-A型CRISPR-Cas系统的众多机制问题并不清楚。据我所知，该课题的国际竞争十分激烈，国内外有多家实验室在开展类似的研究工作。
艳丽团队的这项工作十分漂亮，研究系统全面，该工作综合运用晶体学和低温冷冻电镜的技术手段，获得了多种不同功能状态的精细结构，并辅以充分的生化实验，深刻阐述了III-A型CRISPR-Cas系统的作用机制。
艳丽团队自2015年首次在Cell杂志在线发表了CRISPR-Cas系统中外源片段获取阶段复合物结构重要研究成果研究之后，连年在CRISPR研究领域取得重大突破，包括2016年关于C2c1-sgRNA系统的研究成果，2017年在Cell杂志上连续发表两篇关于CRISPR-Cas系统效应蛋白Cas13a（亦称C2c2）结构与机制研究，以及其他若干重要工作。最新发表的这项工作是艳丽团队在CRISPR领域取得的又一重大突破，显示了其团队在该领域深厚的积累和强劲的实力，又一次为CRISPR-Cas系统的机制阐明做出了原创性的突出贡献。
原始出处：Lilan You,Jun Ma ,Jiuyu Wang,et al.Structure Studies of the CRISPR-Csm Complex Reveal Mechanism of Co-transcriptional Interference.cell.Published: November 29, 2018DOI:https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.10.052
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