真菌检验笔记

01何为真菌？

基本特征

①真核细胞型微生物，属于真菌界；

②具有典型细胞核，有完整的细胞器，不含叶绿素，不分根、茎、叶；

③单核细胞或多核细胞组成的；

④细胞壁含几丁质和β-葡聚糖；

④以寄生或腐生的方式生存，能进行有性生殖或（和）无性生殖

⑤致病性：引起人类感染性、中毒性、变态反应性疾病。

真 菌 的 分 类

（1）分类单位：

（2）按形态分：

①单细胞真菌 ：

酵母菌：如新生隐球菌，以出芽方式繁殖，不形成真假菌丝；

酵母样菌：如念珠菌属，以出芽形成芽管，形成假菌丝。

②多细胞真菌 ：

由菌丝+孢子组成丝状菌（霉菌） 形成菌落为丝状型，如：曲霉、毛霉、青霉、皮肤癣菌等、各种霉菌的菌丝和孢子形态不同，是鉴别真菌的重要标志。

「菌丝」:呈管状，长度随不同的生长条件而异，是由成熟孢子以出芽方式繁殖时形成的。在适宜的环境中由孢子长出芽管，并长出分支而不断生长形成的或有一段菌丝细胞增长而形成，许多菌丝交织成团，成为菌丝体。

A.按形态不同：

螺旋状、球拍状、结节状、鹿角状、梳妆、关节状菌丝等。

B.按结构不同：

有隔菌丝：是由横隔将管状结构的菌丝分隔成一连串多细胞样的丝状体如霉菌、青霉和毛癣菌菌丝（大多致病菌为有隔菌丝）。

无隔菌丝：无隔膜整条菌丝为单个细胞，细胞质内有多个细胞核，根霉和毛霉的菌丝 。

C.根据菌丝生长方式（功能）不同分:

营养菌丝：伸入到培养基内的菌丝。

气生菌丝：露出培养基表面、向空间生长。

生殖菌丝：气中菌丝可生产有性或无性孢子。

菌丝的结构和组成是真菌形态的的一个重要的特征，这有助于对真菌的鉴别。

「孢子」：是真菌的繁殖体，不同的真菌都有其特定的孢子，其形态、大小表面纹饰和色泽等各不相同。

根据繁殖的方式分为两种：

A.有性孢子：是经过两性细胞接合的繁殖方式，通常经过质配、核配和减数分裂三个过程。如：孢子菌丝、皮炎芽生菌、石膏样小孢子菌等。

B.无性孢子（多为病原性真菌繁殖方式）

无性孢子按形态不同分：

①分生孢子：真菌中最常见的一种。

大分生孢子：（多细胞性）其大小、细胞数和颜色是鉴定真菌的重要依据。

体积较大，分隔成较多细胞，长呈梭形，棍棒型，梨形

小分生孢子：（单细胞性）各种真菌都能产生小分生孢子，鉴别意义不大。

体积小，单细胞性外壁薄，有球型，卵形，梨形以棍棒状等各种不同的形态及。

②叶状孢子：菌丝内细胞直接形成

芽生孢子：由细胞出芽生成，多数芽生孢子生长到一定大小即与母体脱离，若不脱离，形成菌丝状，被称为假菌丝

关节孢子：菌丝生长到一定阶段后，出现很多横膈膜，然后从横隔膜处断裂形成矩形、筒形或短柱状的孢子。多出现与陈旧的培养物中

厚膜孢子：菌丝或分支的顶端有少数细胞有菌丝内胞质浓缩、薄壁增厚形成，是为了抵抗不良环境，真菌的一种休眠体。环境适宜时又可出芽繁殖。

③孢子囊孢子：菌丝分支的顶端或孢囊梗膨大形成孢子囊，内含许多孢子，孢子成熟后则破囊而出。如毛霉、根霉等形成的孢子囊孢子。

02真菌检验的基本技术

1.标本直接镜检

•  生理盐水

•  透明胶带法

2.染色镜检法

•  革兰染色（为革兰阳性，为深紫红色）

•  墨汁染色法

•  乳酸酚棉蓝染色法

•  荧光染色

•  糖原染色（PAS）：真菌及组织内的多糖多糖-红色 ；核-蓝色  ;背景-淡绿色。

•  银染色法

•  吉姆萨染色、瑞氏—吉姆萨染色法

•   病理组织染色法

3.真菌培养及鉴定

（1）培养方法

•  点植法

•  划线法

•  直接培养与间接培养

•  试管培养

•  平板培养

•  大培养

•  小培养：玻片法、方块法、小钢圈法

（2）培养条件

•  pH一般在5.0-7.0（大部分真菌适应中性或偏酸环境）；

•  温度：多25-28℃，深部真菌一般37℃；二相真菌26℃左右，为菌丝相，37℃，酵母相。

•  渗透压

（3）常用真菌培养基

4.培养真菌的菌落形态：

①酵母型菌落：（类似一般细菌菌落） 菌落光滑、湿润、柔软、致密，似酵母。为单细胞真菌的菌落，以出芽方式繁殖，如新型隐球菌显微镜检可见圆形或椭圆形生芽细胞。

②类酵母型：外观性状同酵母型菌落，但除有生芽细胞外， 还有假菌丝伸入培养基中，是由伸长的芽生孢子形成如白念珠菌。

③丝状菌落：菌丝疏松，呈棉絮状、绒毛状或粉末状等，一部分菌落向上生长并形成孢子，一部分深入培养基下层。菌丝正面和背面可显示各种不同的颜色，常作为鉴定菌种的参考。

6.临床标本的真菌学检查

（1）根据标本类型分为：

①血液标本

②骨髓标本

③中心静脉导管标本

④脑脊液标本

⑤痰、肺泡灌洗液、保护毛刷标本

⑥分泌物标本

⑦尿液标本

⑧粪便标本

（2）根据侵袭部位分 ：

皮肤黏膜感染性真菌 ：

①皮肤癣真菌

毛癣菌属

表皮菌属：只有絮状表皮癣菌致病

小孢子菌属

②表面感染真菌

③皮下组织感染真菌：引起头癣、足癣、股癣、甲癣、体癣

引起侵袭性感染性真菌：

①酵母型真菌：念珠菌属、隐球菌属

②丝状真菌：曲霉、毛霉、镰刀菌属

③卡氏肺孢菌

④二相性真菌：组织胞浆菌、马尔尼菲青霉、粗球孢子菌、副球孢子菌

「二相性真菌」:

二相性：有些真菌可因营养、温度、颜色等环境的改变，二两种形态发生互变。

二相性真菌：在体内或体外含动物蛋白的培养基上37℃培养为酵母型真菌；在体外普通培养基上25℃培养为霉菌型真菌，如球孢子菌、组织胞浆菌、芽生菌和孢子丝菌、副球孢子菌。

03教师补充

1、曲霉和毛霉的鉴别要点:①曲霉有隔，毛霉无隔②曲霉呈透明二叉分支（分枝呈45度角），毛霉无分枝

2、质谱仪:将待检菌薄薄涂于靶板上（96孔）加甲酸破坏细胞壁释放出蛋白质等物质待干后加基质与释放出来的蛋白质结合形成结晶，根据结晶大小进行打条带，与质谱库菌进行对比。

3、在实验室中一定要注意生物安全，学会保护自己，操作中注意无菌操作

4、G实验鉴别深部真菌（主要是念珠菌）、GM实验鉴别曲霉，都是辅助诊断的的指标，影响因素比较多。