Nature Neuroscience:揭示肠道大脑的复杂性

肠神经系统（ENS）也被称为“肠道中的大脑”，长期以来一直是个谜。它调节所有重要的肠道功能，包括消化和营养吸收、免疫反应、微生物区系定植和肠道屏障功能，因此对生物体的动态平衡和身体功能有很大的影响。虽然ENS发育的早期步骤相对较好，但其神经元复杂性是如何在发育过程中产生的，以及ENS神经元多样性的分子线索在很大程度上仍是未知的。

一项新的研究提出了ENS发育中神经元多样化的一个令人兴奋的新模型，并建立了肠神经的详细分子分类学。他们的发现为ENS研究和开发基于细胞的ENS疾病疗法开辟了新的天地。Morarach和Mikhailova等人的研究在Nature NeuroScience上提供了这些耐人寻味的问题的答案。该研究使用单细胞RNA测序(RNA-seq)来描述发育中和幼年的ENS，在ENS中发现了一种新的神经元多样化的概念模型，并基于大量的分子标记建立了一种新的肠神经元分子分类。

12个独特的ENC产生于发育过程中的二元分裂，随后出现了有丝分裂后神经元群体的多样化。左图：在ENS发育过程中，内皮祖细胞通过神经母细胞(NB)分化，并经历二元分裂：细胞沿着A分支或B分支分化，EPC是通过有丝分裂后神经元的后续分化而产生的。ENC 5和11很可能是在出生后出现的。图中所示为胚胎期18.5天的分枝。右图：小鼠小肠肌间神经丛中的12种独特的ENC是通过它们独特的表达模式组合(转录因子、神经化学标志物、粘附分子等)来识别的。IPAN，内源性初级传入神经元。

以前关于神经元多样性的分子基础的工作一直受到从神经节中分离存活的神经元的技术挑战的阻碍。作者使用一种改进的细胞分离方案分离出比他们之前的研究多得多的ENS神经元。他们还使用了一种新的Cre-line，这种Cre-line可以广泛地标记肠道神经元，并允许有效地丰富ENS神经元。通过这种改进的方法，他们根据幼年小鼠肌间神经丛中分离出的神经元的单细胞RNA-SEQ，对12个肠神经元类(ENCs)进行了全面的分类。利用与已建立的标记的广泛共染色，他们能够将这12个神经元类别与先前发现的功能性肠神经元类型的分子特征联系起来，从而将ENCs分类为兴奋性和抑制性运动神经元、中间神经元和内在初级传入神经元(图1)。重要的是，这一分析表明，每个ENC都可以通过其转录因子基因和其他基因家族在独特组合(例如，黏附分子和突触可塑性调节器)中的表达来区分。这些发现提出了一组新的分子玩家，现在可以测试它们在调节ENS中干细胞维持、神经元分化和规范以及电路形成方面的作用。这项工作产生了许多新的研究问题和方向，从神经元多样化的分子控制到连接，所有这些都是对神经元发育和功能知之甚少的领域。

然后，作者着手确定这种神经元多样性是如何产生的，这对ENS的发展提出了挑战。在ENS发育的早期阶段，神经嵴来源的肠源性祖细胞(EPC)迁移到肠道并沿其迁移。在CNS，干细胞通常定位在不同空间上的干细胞区域，提供分化信号。这种完全不同的发育过程提出了一个问题，即在没有固定位置同一性的高度活跃的内皮祖细胞群体中，神经元多样化是如何调节的。为了解决这个问题，作者在两个时间点对整个小肠ENS进行了单细胞RNA-SEQ，这两个时间点跨越了大多数肌间神经元产生的发育期。

首先，作者鉴定了三种不同状态的细胞：内皮祖细胞、暂时性的神经母细胞群体和分化或成熟的神经元。将他们之前识别的ENC映射到发育轨迹上，他们发现了一个二元分裂，证实了先前的谱系追踪实验的结果，其中ENC 8-12通过分支A产生，ENC 1-7通过分支B产生。利用沿着发育轨迹的基因表达模式，他们发现了ENS内神经元多样化的一个新的创新概念：不是不同的干细胞池产生不同的ENC，而是增殖的祖细胞首先沿着一个或另一个分支分化成神经元(ENC 1或8)。随后，有丝分裂后神经元继续在一个或另一个分支内分化，下调具有一种ENC类型特征的基因表达模式，并分化为另一种ENC。与神经系统的其他部分相比，这是一种全新的思考神经元分化过程的方式。它提供了一个令人信服的模型，说明所处干细胞区空间位置差异不大的祖细胞如何沿时间轴调节它们的分化模式。

为了支持他们的多元化模式，Morarach和Mikhailova等人从功能上检测转录因子Pbx3在胚胎15.5天从ENC8/9到ENC12的转换点的作用。Pbx3的表达模式表明它负调控ENC8/9的同源性。Pbx3在抑制ENC8/9表型和正向调节ENC12同一性分化方面的功能与其一致的神经元亚型所占比例确实发生了变化。失能数据也支持他们的多元化模式。现在，可以测试更多的转录因子在神经元多样性产生中的作用。

本研究为ENS群落提供了亟需的关于调控神经元分化和规范的分子机制的全面资源。下一步，测试它们在神经元发育中的功能并进一步证实本文提出的神经元多样化模型将是非常重要的。这项研究的重点是小肠肌间神经丛中的ENC；最近的其它研究质疑了小鼠和人类ENS中肠道其他部分的基因表达谱，并强调了肠道区域之间的保守基因表达模式以及肠道亚群之间的区域差异。从功能上测试本研究和其他研究中确定的基因将回答有关ENS区域化程度的重要问题：整个肠道的神经发生程序的组成部分是什么，哪些基因构成了肠道内的区域调控程序。这项工作提供的信息超越了神经元多样性是如何在神经内窥镜中产生的重要基础知识。许多ENS疾病的遗传学基础尚未确定，这也是由于对调节ENS发育的基因缺乏了解。从功能上评估神经元分化的基因将有助于发现新的候选疾病基因。了解神经内分泌系统神经元发育的基因调控程序，对于确定其他人类疾病(如自闭症谱系障碍)中因神经内分泌系统功能障碍引起的胃肠道症状的遗传基础也很重要。此外，解剖神经元亚型并确定它们的分子组成可能为针对神经元亚型的治疗方法提供新的分子靶点。

许多带有神经元成分的肠道疾病只能通过对症或手术切除受影响的肠道区域来治疗，例如先天性巨结肠，其特征是肠道远端区域缺乏神经元。治疗这种ENS障碍的一种方法是通过修复性细胞疗法，使用干细胞来获得ENS神经元，这种方法需要详细了解ENS在发育过程中如何产生神经元多样性，成功恢复所有类型的ENS神经元的基准，然后这些神经元可以转化为人类ENS。本研究为实现这一目标做出了重要贡献。

原文出处：

1.Ganz Julia,Revealing the complexity of the gut's brain.[J] .Nat Neurosci, 2021, 24: 1-2.

2.Morarach Khomgrit,Mikhailova Anastassia,Knoflach Viktoria et al. Diversification of molecularly defined myenteric neuron classes revealed by single-cell RNA sequencing.[J] .Nat Neurosci, 2021, 24: 34-46.