Molecular Cancer ： 肝细胞癌连续取得进展！蔡秀军/梁霄揭示环状RNA介导索拉非尼耐药的新机制

肝细胞癌是最常见的原发性肝癌，而作为肝癌大国，有超过50%的新发肝癌发生在我国。索拉非尼是首个FDA批准的用于晚期肝细胞癌靶向治疗的药物。但由于肝癌的发生发展机制复杂且异质性大，在接受索拉非尼治疗6个月后，大多数患者会对索拉非尼产生耐药性，使得疾病进一步恶化，给治疗带来了巨大的困难。

2020年11月23日，浙江大学医学院附属邵逸夫医院蔡秀军及梁霄共同通讯在Molecular Cancer（IF=15.302）在线发表题为“N6-methyladenosine-modified circRNA-SORE sustains sorafenibresistance in hepatocellular carcinoma by regulating β-catenin signaling”的研究论文，该研究阐述了circRNA-SORE (a circular RNA upregulated in sorafenib-resistant HCC cells）介导索拉非尼耐药的机制，同时发现了调控circRNA-SORE表达水平的表观遗传学机制。

总之，该研究表明了维持索拉非尼耐药性的新机制，并且是针对索拉非尼治疗的HCC患者靶向circRNA-SORE的概念验证研究，作为晚期HCC的新型药物干预措施。

另外，2020年11月13日，浙江大学王晓健及蔡秀军共同通讯在Nature Communications 在线发表题为“IRF3 prevents colorectal tumorigenesis via inhibiting the nuclear translocation of β-catenin”的研究论文，该研究发现在AOM / DSS和Apcmin / +模型中，IRF3缺陷小鼠对肠道肿瘤的发展高度敏感。 该研究发现了处于静止状态的胞质IRF3通过阻止Wnt /β-catenin信号传导抑制结直肠肿瘤发生。因此，该研究将IRF3鉴定为Wnt /β-catenin途径的负调节剂和Wnt相关肿瘤发生的潜在预后标志物，并通过IRF3-β-catenin轴描述了肠道菌群与CRC之间的联系（点击阅读）。

研究数据表明，circRNA-SORE可作为ceRNA（竞争性内源性RNA），通过吸附miR-103a-2-5p和miR-660-3p，从而竞争性激活Wnt /β-catenin途径来诱导索拉非尼耐药。更重要的是，团队发现circRNA-SORE中特定腺苷的N6-甲基腺苷（m6A）水平升高有助于维持其RNA的稳定性，继而使circRNA-SORE的含量升高，促进了耐药的产生。本研究在国际上首次提出circRNA上特定位点的m6A修饰可通过RNA稳定性影响其表达水平，是对肝癌表观遗传学分子机制的创新性探索，阐述了肝癌靶向治疗耐药性产生的新机制，为寻找晚期肝癌病人新型治疗靶点提供新的线索。

图1. 机制展示

研究团队首先在前期的研究中建立了索拉非尼耐药的肝癌细胞系，并找到了在耐药形成过程中扮演重要角色的circRNA-SORE。与预期相符的是，circRNA-SORE在索拉非尼耐药的细胞和动物肿瘤中，表达均明显上升，且对于维持索拉非尼耐药性至关重要。在耐药细胞中，沉默circRNA-SORE使得细胞增殖明显减少、凋亡显着增多且克隆形成能力明显下降。研究团队认为，沉默circRNA-SORE主要通过诱导了肿瘤耐药细胞的凋亡，提高了索拉非尼的疗效。

图2.circRNA-SORE在索拉非尼耐药的肝细胞肝癌中明显升高，并且在耐药性的维持中发挥重要意义

CircRNA最常见的作用机制是作为ceRNA，吸附各种各样的miRNA，导致原本与miRNA结合的mRNA的翻译不能被miRNA阻止，形成了mRNA的竞争性激活，从而引起下游蛋白表达水平的升高而产生相应的生理病理表现。那么circRNA-SORE是否也具有miRNA海绵的特性呢？

图3. circRNA-SORE作为ceRNA吸附miR-103a-2-5p和miR-660-3p，竞争性激活wnt /β-catenin途径诱导索拉非尼耐药

首先，研究团队通过基于TargetScan & miRanda的miRNA结合预测软件，获得了12个预测与circRNA-SORE结合的miRNA，并针对circRNA-SORE进行RNA-pulldown实验分析验证，发现有8个miRNA在circRNA-SORE上有明显的富集，证明circRNA-SORE确实可以扮演了ceRNA的角色。进一步功能实验表明，过表达miR-103a-2-5p和miR-660-3p的mimics后，耐药细胞对索拉非尼的敏感性显着提升。

为了探究circRNA-SORE调控miR-103a-2-5p和miR-660-3p的具体机制，研究团队首先应用荧光原位杂交技术发现circRNA-SORE与miR-103a-2-5p和miR-660-3p在细胞中存在着共定位，符合两者结合的特征。RNA免疫共沉淀显示进一步提示miR-103a-2-5p和miR-660-3p可与circRNA-SORE相结合。circRNA-SORE与Ago2的结合在耐药株中更容易被检测到，进一步提示了circRNA-SORE作为ceRNA功能的特性。针对circRNA-SORE上特定位点突变的双荧光素酶报告试验进一步提示了circRNA-SORE与miR-103a-2-5p和miR-660-3p的结合。

图4. CircRNA-SORE与m6A的关系，以及circRNA-SORE在动物模型中扮演的角色

circRNA-SORE结合miR-103a-2-5p和miR-660-3p后又是如何调控索拉非尼耐药的表型呢？在肝癌中，wnt /β-catenin通路起到十分关键的作用，而研究团队发现，耐药细胞中β-catenin的蛋白水平明显高于野生细胞，且其表达量与circRNA-SORE的表达水平呈正相关。进一步实验证明，耐药细胞中的β-catenin及其上游wnt2b的蛋白水平均受到circRNA-SORE以及miR-103a-2-5p和miR-660-3p的调控，并且相应的表型实验结果均与调控方向相符，说明circRNA-SORE调控的这两个miRNA的下游很有可能就是wnt/β-catenin信号通路。基于这个假设，研究团队针对wnt2b的mRNA与miR-103a-2-5p及miR-660-3p的结合位点预测，并进行位点突变前后的双荧光素酶报告实验。系列结果显示，miR-103a-2-5p和miR-660-3p可与wnt2b的mRNA 3‘UTR区结合，促进了mRNA的降解，从而抑制了wnt2b/β-catenin信号通路。

至此，研究团队通过实验证明了circRNA-SORE以ceRNA的角色吸附隔离miR-103a-2-5p和miR-660-3p，竞争性激活了wnt /β-catenin信号通路，诱导并维持了肝癌对索拉非尼的耐药。

在非编码RNA的研究中，引起RNA表达异常的原因始终是困扰众多研究者的问题之一。m6A是RNA修饰中最为丰富的一种，研究者不断地发现RNA的m6A修饰在肿瘤的进展中扮演重要功能，而近年来研究者发现，circRNA的m6A修饰（常发生在RRm6ACH模体上，R？=？G or A； H？=？A， C or U）可对其功能产生调控作用。circRNA-SORE上是否存在m6A修饰？m6A修饰在其中会扮演什么样的角色？带着前沿问题，研究团队首先通过SRAMP和RMBase v2.0数据库预测，发现位于circRNA-SORE序列的juction位点附近存在一个极有可能被m6A修饰的位点。RNA Pulldown试验表明，circRNA-SORE可与YTHDF1、YTHDF2、METTL3和FTO这些m6A相关的酶蛋白来相结合，提示circRNA-SORE可能被m6A调控。

甲基化RNA免疫共沉淀 (methylated RNA Immunoprecipitation，meRIP)实验表明，耐药细胞中circRNA-SORE的m6A修饰水平较野生细胞增高。研究团队进而对m6A修饰相关蛋白进行沉默发现，敲减METTL3和METTL14后，circRNA-SORE的m6A修饰水平显着下降，而敲减FTO后，其修饰水平显着升高，提示了circRNA-SORE上m6A修饰位点的存在。一系列实验表明，circRNA-SORE不仅被m6A修饰，其表达水平也受到m6A修饰水平的调控。

然而，目前仍不确定的是，这种调控作用是在整体m6A水平上，还是特定位点的m6A水平上？为了回答这一问题，研究团队进行了进一步探究，设计了一套针对circRNA-SORE中m6A位点的序列特异性吗啉代反义寡核苷酸（MAO）。与对照MAO（MAO-NC）处理的细胞相比，在用MAO靶向circRNA-SORE（MAO-SORE）处理的HepG2-SR细胞中，m6A水平显着降低。更令人兴奋的是，研究团队采用了最新的CRISPR-Cas9-ALKBH5复合物对m6A位点进行定点去甲基化技术，进一步证实了circRNA-SORE上存在预测的m6A位点，而将m6A位点突变的后，circRNA-SORE的m6A修饰水平明显降低。

相关研究表明，m6A修饰涉及转录后RNA代谢的所有方面，包括mRNA定位，剪接，翻译和降解，进而调节重要的生物学过程。研究团队发现，沉默腺苷甲基转移酶METTL3 / 14可降低circRNA-SORE的水平。值得注意的是，MAO-SORE可以降低耐药细胞中的circRNA-SORE水平，但不能降低野生细胞中的circRNA-SORE水平，进一步提示m6A修饰可能促进circRNA-SORE在耐药细胞中的上调。有趣的是，应用放线菌素D的RNA稳定性试验表明，在耐药细胞中，MAO-SORE降低了circRNA-SORE的稳定性，同时野生型circRNA-SORE比m6A位点突变的circRNA-SORE更稳定。这些结果表明，m6A修饰可能通过增加circRNA-SORE的稳定性来调节其表达。

最后，研究团队利用构建的CDX小鼠肝癌成瘤模型及其对应的索拉非尼耐药模型，在体内水平证实了circRNA-SORE可以通过wnt /β-catenin途径来诱导索拉非尼耐药。

综上，研究团队发现circRNA-SORE在索拉非尼耐药形成过程中发挥了重要的作用。本研究设计严谨、思路新颖，为肝细胞肝癌的临床诊疗提供了新的思路。蔡秀军及梁霄是论文的通讯作者，徐俊杰博士后为论文的第一作者。该项研究受到国家重大科研项目、国家自然科学基金项目、浙江省重点研发计划、中国博士后科学基金项目、浙江省自然科学基金等资助。

原始出处：

Junjie Xu, Zhe Wan, Minyue Tang, et al.N 6-methyladenosine-modified CircRNA-SORE sustains sorafenib resistance in hepatocellular carcinoma by regulating β-catenin signaling.Mol Cancer. 2020 Nov 23;19(1):163. doi: 10.1186/s12943-020-01281-8.