CAR-T细胞生产工艺中的关键环节有哪些？如何规模化、安全稳定的生产制备？
2022-08-08 上海细胞治疗工程技术研究中心 上海细胞治疗工程技术研究中心
CAR-T细胞产品作为“活的”药品，与传统生物制品相比，其在生产工艺、质量研究、质量控制、放行检测和稳定性研究等方面均需要特殊考量。
嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法作为肿瘤免疫细胞治疗领域的典型范例，已成为肿瘤治疗历史上里程碑式的成就。据Coherent Market Insights预测，在2018-2028年期间，全球CAR-T细胞治疗市场规模的平均年复合增长将达46.1%，预计到2030年市场规模可达218亿美元。
面对如此巨大的市场，药企们也在加速布局，临床进展不断提速。数据显示，全球在clinicaltrials.gov上注册的CAR-T临床项目已达700多项。纵观国内，累计有近40款CAR-T疗法正在研发中。随着越来越多的CAR-T产品即将步入临床，如何快速规模化地进行相对“个性化”的生产制备，并保证产品安全性和质量稳定性，是大家面临的一大挑战。
CAR-T细胞生产过程包括T细胞的富集和分离、CAR-T细胞的制备和终产品的低温贮藏。其中制备过程包括T细胞在体外的激活与扩增、CAR基因的转导、CAR-T细胞的扩增等步骤。本文简要概述CAR的基因转导与CAR-T细胞培养这两个关键环节。
1关键环节一：CAR基因转导
在基因转导环节，CAR的结构设计、基因转导方式、转导效率等都是关键的影响因素。
自本世纪初，人们一直致力于修饰、改造CAR-T结构的胞内信号转导区，根据“共刺激分子序列”结构的不同，CAR-T 细胞可分以下五代：
第一代CAR-T仅有胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号转导结构域组成，诱导T细胞激活仅通过CD3ζ信号域激活，缺少共刺激信号，细胞活性和效力很弱，需要外源性给予细胞因子；
第二代CAR-T中增加了一个4-1BB、或CD28、或OX40分子共刺激结构域，增强来自TCR-CD3的信号，细胞增殖能力和杀伤毒性都大大的增加，目前大多数产品使用的是二代CAR结构，如：诺华的Kymriah和吉利德的Yescarta；
第三代CAR-T增加了两个或更多共刺激结构域，以提高CAR-T的活性和效力。但是第三代的临床表现并不优于第二代CAR-T；
第四代CAR-T在二代的基础上可表达特定的细胞因子（IL-2、IL-12、IL-15等），克服了肿瘤免疫微环境的抑制，通过修饰肿瘤微环境募集并活化其他免疫细胞进行免疫反应，进一步增强对肿瘤的杀伤作用；
第五代通用型CAR-T敲除异体T细胞上的TCR（T细胞抗原受体）、MHC以及相关信号通路基因，以避免异体型CAR-T细胞的宿主排斥反应。
目前，主要有两种病毒载体用于CAR-T细胞基因转导：γ逆转录病毒载体和慢病毒载体。其中慢病毒载体在科研和临床开发中越来越受到青睐，主要因其具备以下优势：
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慢病毒更安全，更低的致癌转化和随机转基因整合风险；
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应用范围更广，可转导分裂/非分裂细胞；可以转导多种细胞，包括难以转导的造血前体细胞、神经元细胞、淋巴细胞和巨噬细胞等；
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慢病毒转基因负荷量更大，可容纳6.5kb的外源基因且基因毒性更小；
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慢病毒介导的基因表达持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂；
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慢病毒生产成本较低；
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慢病毒的转导效率接近100%，高于γ逆转录病毒。
作为递送基因的载体工具，高质量的慢病毒产品是CAR-T细胞药物有效性及安全性的保证，因此其慢病毒产品的质量表征是关键。临床试验中要求准确调整病毒载体剂量和细胞转导效率，并对最终产品进行严格的质量控制以保证其安全性。
目前慢病毒最精确滴度测量方法是，感染细胞后，使用qPCR来检测整合到靶细胞基因组中的前病毒拷贝数。这种方法可以区分多个整合事件，减少低估病毒滴度的可能性。此方法的主要缺点是工作量较大，需要用病毒制剂的连续稀释液转化靶细胞，分离基因组DNA，并使用针对病毒成分或转基因本身的引物来量化整合事件的数量。
表征细胞感染效率的关键参数是感染复数（MOI），即感染时病毒与细胞数量的比值。理论上MOI值越大，感染效率越高，但对细胞的毒性也越大，适宜的MOI值是高感染效率的关键因素之一。慢病毒的感染能力随细胞类型的不同而不同，因此每种不同的细胞类型需要不同的MOI。理想情况下，MOI与感染细胞数量之间应呈线性关系。
然而由于病毒结构的复杂性，慢病毒产品的质控也很重要。慢病毒GMP生产的一些特异性检测包括评估慢病毒载体的纯度与特性，如蛋白质和DNA污染物；形态和基因组完整性；安全性，如可复制型慢病毒、外源性病原体，支原体，内毒素/热原；病毒效力，如总/活性慢病毒颗粒；以及最终批次的其他理化性质，如pH、渗透压、电导率。慢病毒规模化生产的产能、成本、质量等各方面都将直接影响着CAR-T产品最终的治疗应用。
2关键环节二：CAR-T细胞扩增培养
在 CAR-T 治疗过程中，需将经过技术改造的 T 细胞进行体外培养，达到符合治疗要求的细胞数量后，再回输到病人体内靶向杀死癌细胞。在CAR-T生产中，补充细胞因子以增强体外CAR-T细胞的增殖是一种常见的做法。IL-2可诱导T细胞扩增，通过调节IL-2浓度，可以增加早期记忆细胞数量。
另外，CAR-T细胞扩增还需要重点考虑如何保持CD4+和CD8+T细胞的平衡。而且，非转导的T细胞在有外源刺激因子刺激时也可以扩增。扩增时间受限于技术和培养体系的选择，通常需要1-2周。目前T细胞体外快速扩增仍然是一个挑战，即使有细胞因子的参与，扩增的速度和稳定性仍然需要进一步的探索和优化才能实现。
目前，绝大部分企业的CAR-T细胞制备仍旧是纯手动化生产，这样的生产方式不仅导致产品被污染的风险增加，而且容易产生产品批次间差异。另外，CAR-T的生产过程需由B级条件下的生物安全柜保障全过程的无菌性，因此对生产人员的无菌操作提出了极高的要求。CAR-T细胞产品一旦被细菌污染，现有技术都无法对其进行除菌，因此，监管部门对细胞治疗产品的GMP生产有着特别严格的环境清洁度和操作要求。环境监测必须严格验证，实时监测。而且，CAR-T细胞疗法是一种自体产品，不同患者的细胞之间应当避免交叉污染。
根据我国首个《CAR-T细胞制剂制备质量管理规范》，CAR-T细胞产品在生产时的每一个环节都应严格遵循临床要求。
总之，CAR-T细胞产品作为“活的”药品，与传统生物制品相比，其在生产工艺、质量研究、质量控制、放行检测和稳定性研究等方面均需要特殊考量，因此面临的挑战更大，需要更加全面和充分的分析方法来保证CAR-T细胞质量控制方法的稳定性和高效性。
参考资料：
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