荧光PCR增强剂及抗抑制作用

2023-02-03 检验之声 检验之声 发表于安徽省

荧光PCR增强剂是解决PCR抑制问题的有效方法。目前已开发出多种荧光PCR增强剂,可有效增加所需PCR产物的产量或减少非特异性扩增。

新冠肺炎疫情三年,让核酸检测家喻户晓。PCR作为核酸检测的主流技术,检验人都已经驾轻就熟。然而,PCR技术在临床实践中,由于生物样本复杂,或来源于收集、处理样本的过程不当而造成的PCR抑制现象时有发生。PCR抑制会显著降低PCR的灵敏度和扩增效率,对检测结果造成干扰,降低结果的准确性。

PCR增强剂是可以改善 PCR及PCR衍生技术的灵敏度、特异性、保真度等的一类添加剂,可以显著改善假阳性、假阴性或无法扩增等情况,使准确度提高,检测的最低检出限提高,甚至当调整循环数、镁离子、引物、dNTP、DNA 聚合酶和 DNA模板浓度等优化方案无法解决问题时,能够提出一种更有效的策略,这种策略突破了原有检测技术的缺陷,对于病原体正确、快速的诊断具有重要意义。目前关于PCR增强剂存在很多类型,不同类型的PCR增强剂也针对不同核酸扩增问题提出了一定的解决方案。

荧光PCR增强剂是解决PCR抑制问题的有效方法。目前已开发出多种荧光PCR增强剂,可有效增加所需PCR产物的产量或减少非特异性扩增。PCR增强剂作用原理各不相同,有着各自独特的适用背景:

下面就各种增强剂进行详细介绍:

亚精胺

有研究显示[1],亚精胺表现出显著的抗胆酸盐、尿素和血红素抑制的效果。WAN等[2]的研究结果也显示,亚精胺对PCR有增强作用,其原理是小分子亚精胺通过促进聚合酶、引物和模板的结合来促进 PCR起始复合物的形成,微摩尔浓度的亚精胺可显著增强植物基因组DNA的扩增。

海藻糖、BSA和Tween-20

海藻糖、BSA和Tween-20对虾壳成分有抗抑制作用,因此常被用于检测虾样本中病毒的PCR方法中[3]。此外,BSA可以提高rTth酶对生物样本的抗性,且BSA中的赖氨酸含量高,可结合核酸提取过程中残留的酚类化合物,保护TaqDNA聚合酶活性,从而起到增强PCR扩增效率的作用[4]。

甜菜碱

甜菜碱具有破坏富含GC的DNA序列的能力,可提高PCR扩增的产量和特异性。

硫酸铵

在中药材鉴定中,硫酸铵可以优化引物与模板的特异性结合,提高PCR的特异性。研究结果显示,硫酸铵具有显著的抗尿素抑制作用[1]。

PEG600和甘油

另有研究结果显示,PEG600和甘油可通过增强酶的热稳定性及保护酶活性来提高PCR产物的产量[5]。

刘文霞[1]等研究报道,不同浓度增强剂抗胆酸盐、尿素和血红素抑制作用(详见表1)

表1PCR Enhancer

在PCR反应中,PCR Enhancer能够有效降低高GC模板和具有复杂二级结构模板的解链温度,极大地减少DNA二级结构对PCR的影响,增加PCR反应的灵敏度和特异性,且兼容几乎所有DNA聚合酶的扩增体系。当优化PCR程序无法有效扩增目的片段时,加入PCR Enhancer往往能得到意想不到的结果。但是可能会降低PCR的保真度。因此,在进行高保真PCR时慎用。增强剂能与所有的耐热DNA聚合酶共同作用促进许多DNA模板的有效扩增,增加PCR反应的灵敏度和特异性。在PCR反应中,PCR增强剂主要通过提高DNA聚合酶的热稳定性,降低DNA的二级结构起作用。因此在遇到一些复杂模板时(如GC 含量高),可通过提高退火温度,极大地减少DNA 二级结构对PCR 的影响,同时对酶的活性没有改变产品特点:Enhancer适合灵敏度要求较高的PCR、 RT-PCR、Multiplex PCR、 PCR条件的优化和GC含量很高的DNA扩增。

专家点评

李玉杰  同济大学附属东方医院胶州医院检验科主任  主任技师

针对PCR抑制物的干扰,添加剂成为解决此问题的有效方法。学者们已发现了越来越多的PCR增强剂,可在不同方面抵抗PCR抑制作用,如提高PCR的特异性、增加PCR扩增的产量及防止无效扩增等。在临床检验中,血液中的血红素、尿液中的尿素、粪便中的胆酸盐均对PCR有抑制作用。为此,本文介绍了PCR增强剂对临床检验中常见的PCR抑制物的消除效果,以指导临床PCR检测假阴性结果的处理,提高临床检测准确性。

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