当代谢遇上表观遗传，如何登上顶刊？Nature子刊告诉你秘诀！

2022-09-23 TS MedSci原创

肿瘤研究日益内卷，在肿瘤领域发表高分文章更是难上加难。

肿瘤研究日益内卷，在肿瘤领域发表高分文章更是难上加难。

其实，顶刊最注重的东西无非是两点：创新性和逻辑。因此，在科研工作中，我们在选择研究方向及完成实验设计时必须注意这两点，才能顺利发表顶刊。

今天我们通过一篇今年7月15日发表于Nature Communications上的一篇文章“Hypoxia induces HIF1α-dependent epigenetic vulnerability in triple negative breast cancer to confer immune effector dysfunction and resistance to anti-PD-1 immunotherapy”举例说明一下这项研究如何选取科学问题，如何挖掘现象级热点，如何步步为营发表肿瘤研究顶刊。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-31764-9

一、研究背景

三阴性乳腺癌 (TNBC) 是乳腺癌中预后最差的一种分型，治疗选择有限。尽管其在肿瘤微环境中免疫原性较高、肿瘤浸润淋巴细胞比率也很高，并且目前的免疫治疗 (抗PD-1/ PD-L1) 虽然取得了部分成效，但总体反应率低于20%，加上患者转移率高，临床预后差，表明 TNBC中存在严重功能失调的肿瘤免疫微环境。

缺氧是大多数实体瘤肿瘤微环境的一个共同特征，与癌症进展和转移密切相关，且缺氧程度在TNBC明显高于其他乳腺癌亚型。然而，缺氧是否会诱导免疫逃避仍不清楚，且缺氧介导免疫治疗耐受的分子机制也尚未可知。

二、研究思路

1. 临床问题的提出：三阴性乳腺癌PD-1治疗抵抗

聚焦难题：三阴性乳腺癌预后最差；聚焦新问题：免疫治疗抵抗。

2. 科学问题的提出：缺氧通过调节肿瘤微环境调控免疫反应

聚焦热点：代谢问题（缺氧）；肿瘤微环境

3. 解决问题：富含逻辑性，每一步之间联系紧密，并通过新的热点现象解释机制

3.1 表型：缺氧与人和小鼠三阴性乳腺癌 (TNBC) 的免疫排斥有关（figure1），缺氧导致人类 T 细胞功能障碍和终末衰竭（figure2）。（表型从相关性递进到确定关系，对临床样本的合理利用）

3.2 机制：缺氧诱导免疫效应表达的表观遗传失活（figure3），缺氧诱导的效应表达的表观遗传失活依赖于 HIF1α（figure4）。（机制偶联表观遗传，解释了缺氧和表观遗传的关联-代谢和表观遗传双热点；并通过经典缺氧诱导因子1引出靶点）

3.3 靶点的作用：缺氧（HIF-1α）抑制免疫细胞毒性，削弱干扰素信号，诱导对 PD-1 阻断的抵抗。（进一步确认HIF-1α的重要性）

3.4 药理学水平克服耐药（解决问题）：HIF1α 的药理学抑制、相关的表观遗传事件抑制均可增敏PD-1（通过靶向HIF-1α，阻断中间机制解决所提出的临床问题，闭环研究）

三、研究内容

1. 缺氧与乳腺癌的免疫逃逸有关

为了研究缺氧在调节 TNBC 免疫中的作用，首先通过TCGA数据库表征与 TNBC 中抗肿瘤免疫基因活性相关的缺氧基因特征表达，发现缺氧相关基因在TNBC中显著高表达（figure1a），且与免疫活性基因负相关（figure1b）；并在临床样本中验证出这一结果（figure1c，d），并进一步通过TCGA数据库分析缺氧诱导因子HIF-1α与免疫浸润的相关性，发现负相关（figure1e）。

Figure1：缺氧与三阴性乳腺癌 (TNBC) 的免疫排斥有关

Tip1：利用数据库和临床样本揭示相关性（浅表型），通常使用数据库挖掘出有利表型数据，然后使用临床样本进一步验证。

2. 缺氧导致T细胞功能障碍和终末衰竭

为了研究缺氧对 T 激活和分化过程的影响，研究人员进一步将T细胞和 TNBC细胞于缺氧状态下共培养（figure2c），并进行转录组学分析（figure2c）进一步明确基因层面的改变，发现缺氧处理后T细胞活性的相关分子显著上调，而T细胞耗竭相关分子显著上调（figure2d，e）。同时，缺氧共培养后免疫检查点表达显著增高（figure2f），且PD-1及TIM-3双阳性T细胞比例显著上调，但是KI67并无上调（figure2i），这说明缺氧诱导的免疫耗竭并非是由细胞增殖引起。

Figure2：缺氧导致人类 T 细胞功能障碍和终末衰竭

Tip2：深入研究表型，免疫研究中需要通过流式细胞术检测不同分子亚型的T细胞，并通过转录组学深入检测与免疫活性相关的基因，进一步说明缺氧诱导的免疫抑制。

3. 缺氧诱导免疫效应表达的表观遗传失活

表观遗传学在免疫细胞功能障碍和衰竭中起着至关重要的作用，且会限制对免疫疗法的反应。因此，研究人员通过表观遗传化合物筛选，以研究缺氧是否参与表观遗传机制来抑制效应子的表达。结果表明，DNMT 抑制剂 5-氮杂胞苷 (AZA) 始终诱导IFNG在 T 和 NK 细胞中的表达（figure3a），且HDAC 抑制剂 Entinostat (ENT) 和 EZH2 抑制剂 EPZ6438 (EPZ) 可挽救缺氧 CD8 +T细胞及N细胞中IFNγ、TNFα 和颗粒酶 B 的表达，起到免疫激活作用（figure3b，c），因此缺氧可通过表观遗传效应改变免疫细胞的活性。

Figure3：缺氧诱导免疫效应表达的表观遗传失活

4. 缺氧诱导的效应基因表观遗传失活是 HIF1α 依赖性的

缺氧诱导了 HIF 依赖性和 HIF 非依赖性分子变化，为了研究 HIF 是否参与缺氧诱导的免疫效应功能障碍，研究人员在TNF启动子处对 HIF1α 和 HIF2α 进行了 ChIP 分析，在与 HDAC1 结合相同的区域中，T 细胞和 NK 细胞的缺氧处理均诱导 HIF1α 的显着增加，但 HIF2α 的富集在IFNG和TNF上没有显着增加（figure4a），且免疫共沉淀实验表明HIF1α与HDAC1在缺氧条件下形成复合物（figure4b），T细胞中的HIF1α敲低消除了效应基因处缺氧诱导的HDAC1富集（figure4从c，d）。这证明缺氧诱导的免疫活性改变及表观遗传调控是依赖于HIF-1α的。

Figure4：缺氧诱导的效应基因表观遗传失活依赖于HIF1α

Tip3：系统阐明机制，对于机制研究，一直是顶刊最注重的部分，所以在机制解释选择上需要尽量向现象级热点接近（比如说本文中的代谢与表观遗传），此处作者发现表观遗传抑制可解决缺氧诱导的免疫耗竭，并详细解释了表观遗传与HIF-1α的相关性。

在此介绍一些引入表观遗传概念的方法：（1）检测表观遗传因子改变；（2）检测染色质稳定性改变；（3）通过表观遗传相关抑制剂引入表观遗传概念；（4）通过甲基化表型引入。

5. 缺氧抑制免疫细胞毒性，削弱干扰素信号，诱导对 PD-1 阻断的抵抗

为研究缺氧诱导的 T 和 NK 细胞中效应子表达的抑制是否会导致细胞毒性受损，研究人员对表达荧光素酶报告基因的TNBC 细胞（BT549 和 MDA-MB-231）进行了 T细胞或 NK 细胞介导的细胞毒性实验检测，发现缺氧抑制了免疫细胞的毒性（figure5a）。且减弱了免疫细胞引发的干扰素（干扰素信号与PD-1抗性密切相关）信号传导（figure5b），且使用 HIF1α 抑制剂（地高辛和 PX478）、EZH2 抑制剂（EPZ 和 GSK126）和 HDAC 抑制剂（ENT 和 SAHA）预处理 T 细胞或 NK 细胞能够回复缺氧条件下免疫细胞对 TNBC 细胞的杀伤（figure5c）。

这部分实验加强了HIF-1α作为靶点的重要性，并为HIF-1α抑制剂及表观遗传抑制剂体外杀伤实验提供了证据。

Figure5：缺氧抑制免疫细胞毒性，削弱干扰素信号，诱导对 PD-1 阻断的抵抗

6. HIF1α 和相关表观遗传的药理学抑制增敏PD-1

为了研究 HIF1α/HDAC1/EZH2 抑制剂在体内的疗效，研究人员使用鼠源性的乳腺癌模型进行研究，结果显示，单独的抗 PD-1 治疗对肿瘤生长的影响最小，但抗 PD-1 与 PX478 或 ENT 的组合可以诱导显着的肿瘤消退（figure6a），且联合治疗还可以有效抑制肺转移（figure6b）及改善生存（figure6c）。此外，在T细胞或NK细胞耗尽的小鼠中，联合治疗效果不明显（figure6d，e）。

Figure6：缺氧抑制免疫细胞毒性，削弱干扰素信号，诱导对 PD-1 阻断的抵抗

Tip4：通过靶向驱动因素或者中间机制解决所提出的临床问题，完成闭环。这种做法即强化了驱动因素（靶点）的重要性，又验证了机制的确切性，同时解决了所提出的临床问题，这种研究要兼顾体内及体外模型，如果所采用的模型更为前沿（类器官、PDX等）将有更好的效果。

综上所述，作者可以将这项研究发表于Nature子刊，其工作量和创新性都很高，而对于创新性这一难点问题，我们在研究中可采取的方法就是，细化临床问题，提出前沿性临床问题，针对此的解决方案要更系统更全面（多个现象级机制），最后要通过药理学手段解决问题（提出联合治疗策略），提高文章意义。

参考文献：

Ma S, Zhao Y, Lee WC, et. al. Hypoxia induces HIF1α-dependent epigenetic vulnerability in triple negative breast cancer to confer immune effector dysfunction and resistance to anti-PD-1 immunotherapy. Nat Commun. 2022 Jul 15;13(1):4118. doi: 10.1038/s41467-022-31764-9.

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