Acta Neuropathologica: 淀粉样前体蛋白C末端片段的积累在阿尔茨海默病模型和人脑中触发线粒体结构、功能和有丝分裂缺陷
2020-10-23 MedSci原创 MedSci原创
最近的一些证据表明，淀粉样前体蛋白衍生的C末端片段（APP-CTFs）可能与阿尔茨海默病（AD）病理学的病因触发有关。线粒体内稳态改变被认为是AD发展的早期事件。
最近的一些证据表明，淀粉样前体蛋白衍生的C末端片段（APP-CTFs）可能与阿尔茨海默病（AD）病理学的病因触发有关。线粒体内稳态改变被认为是AD发展的早期事件。然而，APP-CTFs对线粒体结构、功能和有丝分裂缺陷的具体贡献仍有待证实。
在这里，我们证明在神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中，表达APP瑞典突变或β-分泌酶衍生的APP-CTF片段（C99）结合β-和γ-分泌酶抑制，APP-CTF的积累独立于Aβ触发过度的线粒体形态改变，其与线粒体活性氧生成增强有关。APP-CTFs的积累也引起基础的有丝分裂功能衰竭，表现为LC3的转化增强、LC3-I和/或LC3-II的积累、SQSTM1/p62的不降解、线粒体中Parkin和PINK1不一致的募集、膜和基质线粒体蛋白水平的提高以及线粒体与溶酶体融合不足。
我们还证实了APP-CTFs的积累对γ-分泌酶抑制剂处理的年轻3xTgAD转基因小鼠以及腺相关病毒C99注射小鼠体内形态学线粒体改变和基础有丝分裂功能受损的作用。对2xTgAD和3xTgAD老龄小鼠的比较表明，除了APP-CTFs外，Aβ对晚期有丝分裂的激活有额外的作用。重要的是，我们报告了在人类死后散发性AD大脑中APP-ctf的线粒体积累与有丝分裂失败分子特征相关。
方法：使用添加蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液（50 mM Tris pH 8、10%甘油、200 mM NaCl、0.5%Nonidet p-40和0.1 mM EDTA）制备总蛋白提取物。使用添加蛋白酶抑制剂混合物的分离缓冲液（250 mM D-甘露醇、5 mM HEPES pH 7.4、0.5 mM EGTA和0.1%BSA）分离线粒体部分。在冰上冷冻20分钟并频繁敲打后，细胞、小鼠大脑或解剖的海马被玻璃均浆器120次击碎，匀浆在1500×g、4°C下离心以去除未破裂的细胞和细胞核。收集部分上清液作为总馏分，另一部分在4℃下以10000 × g离心10分钟以沉淀线粒体馏分，将其悬浮在添加有蛋白酶抑制剂的分离缓冲液中。全长APP、APP-CTFs和Aβ在16.5%trisine-SDS-PAGE上分离，然后转移到硝酸纤维素膜上。将膜在PBS中煮沸，在TBS、5%脱脂牛奶中饱和，并与特定抗体一起孵育过夜。其余蛋白均按标准程序进行SDS-PAGE分离。
综上所述，线粒体内稳态缺陷在AD发病机制中起着关键作用，因此通过抑制早期APP-CTFs的积累来靶向线粒体功能障碍和/或吞噬功能可能是AD的相关治疗干预措施。
Vaillant-Beuchot, L., Mary, A., Pardossi-Piquard, R. et al. Accumulation of amyloid precursor protein C-terminal fragments triggers mitochondrial structure, function, and mitophagy defects in Alzheimer’s disease models and human brains. Acta Neuropathol (2020). https://doi.org/10.1007/s00401-020-02234-7
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