自噬研究中的实验技术方法介绍

自噬的过程：
  步骤1：细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜结构，然后不断扩张，但它并不呈球形，而是扁平的，就像一个由2层脂双层组成的碗，可在电镜下观察到，被称为Phagophore，是自噬发生的铁证之一。
 
步骤2：Phagophore不断延伸，将胞浆中的任何成分，包括细胞器，全部揽入“碗”中，然后“收口”，成为密闭的球状的autophagosome，我把它翻译为“自噬体”。电镜下观察到自噬体是自噬发生的铁证之二。有2个特征：一是双层膜，二是内含胞浆成分，如线粒体、内质网碎片等。
步骤3：自噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合（加了个“可”字，意思是这种情况不是必然要发生的）。
步骤4：自噬体与溶酶体融合形成autolysosome，期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，2者的内容物合为一体，自噬体中的“货物”也被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。     
 

自噬的特性： 
 
（1）自噬是细胞消化掉自身的一部分，即self-eating，初一看似乎对细胞不利。事实上，细胞正常情况下很少发生自噬，除非有诱发因素的存在。这些诱发因素很多，也是研究的热门。既有来自于细胞外的（如外界中的营养成分、缺血缺氧、生长因子的浓度等），也有细胞内的（代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等）。由于这些因素的经常性存在，因此，细胞保持了一种很低的、基础的自噬活性以维持自稳。
  （2）自噬过程很快，被诱导后8min即可观察到自噬体（autophagosome）形成，2h后自噬溶酶体（autolysosome）基本降解消失。这有利于细胞快速适应恶劣环境。
  （3）自噬的可诱导特性：表现在2个方面，第一是自噬相关蛋白的快速合成，这是准备阶段。第二是自噬体的快速大量形成，这是执行阶段。
  （4）批量降解：这是与蛋白酶体降解途径的显著区别
  （5）“捕获”胞浆成分的非特异性：由于自噬的速度要快、量要大，因此特异性不是首先考虑的，这与自噬的应急特性是相适应的。
（6）自噬的保守性：由于自噬有利于细胞的存活，因此无论是物种间、还是各细胞类型之间（包括肿瘤细胞），自噬都普遍被保留下来（谁不喜欢留一手呢？）。
 
自噬相关基因（autophagy associated gene, ATG）：在自噬过程中到底有哪些蛋白的参与，即自噬相关蛋白的鉴定是目前自噬研究主要的任务。由于自噬研究的历史关系，很多基因在酵母和哺乳动物中有不同的命名。
 
自噬过程的调控：
从上面总结的自噬特点中可以看出，自噬这一过程一旦启动，必须在度过危机后适时停止，否则，其非特异性捕获胞浆成分的特性将导致细胞发生不可逆的损伤。这也提醒我们在研究自噬时一定要动态观察，任何横断面的研究结果都不足以评价自噬的活性。
 
目前，已经报告了很多因素能诱导细胞发生自噬，如饥饿、生长因子缺乏、微生物感染、细胞器损伤、蛋白质折叠错误或聚集、DNA损伤、放疗、化疗等等，这么多刺激信号如何传递的、哪些自噬蛋白接受信号、又有哪些自噬蛋白去执行等很多问题都还在等待进一步解答中。
 
关于传递自噬信号的通路目前比较肯定的有：
  抑制类 
（1）Class I PI3K pathway （PI——phosphatidylinositol，磷脂酰肌醇）与IRS  (Insulin receptor substrate) 结合，接受胰岛素受体传来的信号（血糖水平高抑制自噬）。
 

（2）mTOR在人类中的同源基因是FRAP1（FK506 binding protein 12-rapamycin  associated
protein 1），是一个丝/苏氨酸蛋白激酶。能接受多种上游信号，如Class I PI3K、IGF-1/2、MAPK，能感受营养和能量的变化。
 
  激活类 
（1）Class III PI3K
结构上类似于Class I PI3K，但作用相反。
 
  接受上述信号的自噬蛋白： 

目前都把焦点集中在beclin 1（酵母同源物为atg6），能与多种蛋白结合，如Vps34（Class III
PI3K的催化亚单位），mTOR，BCL-2和BCLXL蛋白等，需注意的是，beclin-1是一个多功能蛋白，除了接受自噬信号，它还可以接受很多
其它的信号对自噬进行调节，越来越多的证据表明，beclin-1可能是自噬的“守门人”。
 
  自噬体的发生： 
 
目前认为，自噬体的膜不是直接来源于高尔基体或内质网，而是在胞浆中重新生成的，但具体的机制尚不清楚。当beclin-1被活化后，胞浆中先形成很多个membrane  source（自噬体膜发生中心），在它们不断扩展的过程中（phagophore到autolysosome），VMP1蛋白由内质网和高尔基体转位到自噬体膜上（VMP1又叫TMEM49，已知唯一与自噬有关的跨膜蛋白），同时，MAP1-LC3由胞浆型（即LC3-I）转位到自噬体膜（即LC3-II），LC3这一转变过程可被Western Blot和荧光显微镜检测到，现已成为监测自噬体形成的推荐方法。
 
  自噬与细胞死亡的关系： 
有必要说明一下的是，细胞死亡是一个非常复杂的过程，为了研究方便，需进行分类，但我们思考时不要局限于这些人为的分类，而应注重于现象本身来研究其背后的机制。

一直以来人们从不同角度、用不同方法来观察细胞的死亡，并把细胞的死亡方式分为2类：坏死和凋亡，因为两者有着明显的区别，其中最主要的区别之一就是细胞膜的通透性——坏死细胞的细胞膜丧失了完整性，内容物被释放出来，染料可自由进入细胞，而凋亡细胞保持完整，无内容物释放，染料也被排斥。很多实验亦根据这一原理来设计以区分坏死和凋亡，这将在后面一一介绍，如同刚刚说明的那样，这些实验只能说明细胞膜的通透性（必要条件，不是充分必要条件），而不能用来证实坏死细胞或凋亡细胞。 

一般认为坏死是被动的，不可控的，而凋亡是主动的，可控的。为了强调这一点，凋亡被定义为程序性细胞死亡（program cell death，PCD）。但无论是坏死还是凋亡，都是一个过程，是需要时间的（尤其是凋亡，从启动到完成，细胞要执行很多反应），而且细胞死亡后都有“尸体”。
   
在研究自噬与凋亡的关系时，人们发现细胞死亡前胞浆中存在大量的自噬体或自噬溶酶体，但这样的细胞缺乏凋亡的典型特点，如核固缩（pyknosis）, 核破裂（karyorhexis）、细胞皱缩（shrinkage）、没有凋亡小体的形成等，被称为自噬样细胞死亡（autophagic cell death，ACD），它是一种新的细胞程序性死亡，为了与凋亡区别，被命名为Type II cell death，相应的，凋亡为Type I  cell death，坏死为Type III cell death。
 
尽管这样，但对于自噬是否是细胞死亡的直接原因目前还存在很大的争议。到底是Cell death by 
autophagy（自噬引起死亡）还是Cell death with  autophagy（死亡时有自噬发生，但不是直接原因）？对此，自噬研究领域“大牛”级专家Levine  Beth在一篇nature的Review中表达了自己的观点。由于在形态学上2者无明显区别，但通过阻断自噬，观察细胞的结局可区分开来：Cell  death by autophagy细胞存活，而Cell death with autophagy细胞死亡。
 
  自噬与肿瘤的关系： 
 
与凋亡（在肿瘤细胞中一般都存在缺限）不同，自噬是被优先保留的。无论是肿瘤细胞还是正常细胞，保持一种基础、低水平的自噬活性是至关重要的。因为细胞中随时产生的“垃圾”（破损或衰老的细胞器、长寿命蛋白质、错误合成或折叠错误的蛋白质等等）都需要及时清除，而这主要靠自噬来完成，因此，自噬具有维持细胞自稳的功能；如果将自噬相关基因突变失活，如神经元会发生大量聚集蛋白，并出现神经元退化。同时，自噬的产物，如氨基酸、脂肪酸等小分子物质又可为细胞提供一定的能量和合成底物，可以说，自噬就是一个“备用仓库”。如Atg-5缺陷的小鼠在出生后喝上第一口奶之前就会饿死。更重要的是，自噬活性可在代谢应激（饥饿、生长因子缺乏、射线、化疗等）时大大增强，表现为胞浆中迅速涌现大量自噬体，这一现象被称为“自噬潮”（autophagic flux），广泛用于自噬形成的监测。自噬潮为细胞度过危机提供了紧急的营养和能量支持，有利于细胞的存活。
 
  鉴于自噬的上述作用，自噬可为肿瘤细胞带来几大好处： 
（1）肿瘤细胞本身就具有高代谢的特点，对营养和能量的需求比正常细胞更高，但肿瘤微环境往往不能如意，如肿瘤发生初始期到血管发生之前、肿瘤长大发生血管崩塌时、肿瘤细胞脱离原发灶游走时等都会出现营养不足或供应中断，而此时提高自噬活性可以有助于度过这一危机。
 
（2）当化疗、放疗后，肿瘤细胞会产生大量的破损细胞器、损坏的蛋白质等有害成分，而此时提高自噬活性可及时清除这些有害物质，并提供应急的底物和能量为修复受损DNA赢得时间和条件。
 
由于自噬减少了肿瘤细胞在代谢应激时发生坏死的机会，而对于肿瘤细胞群体而言，需要一部分细胞发生坏死，以引发适度的炎症（有利于血管的长入、吸引免疫细胞分泌生长因子等）。研究发现，很多类型的肿瘤在代谢应激时会“组成性”活化PI3K信号以抑制自噬（由于凋亡通路已受阻，抑制自噬会促进坏死），但具体机制尚不清楚。
  {nextpage}
  自噬的研究方法： 
正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的工具药有：
 
  （一）自噬诱导剂 
1.  Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激
2.   Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol  monophosphatase，肌醇单磷酸酶）
3.  Earle's平衡盐溶液：制造饥饿
4.   N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂
5.   Rapamycin：mTOR抑制剂
6.  Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂
 
  （二）自噬抑制剂 
1.  3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制剂
2.   Bafilomycin A1：质子泵抑制剂
3.  Hydroxychloroquine（羟氯喹）：Lysosomal  lumen alkalizer（溶酶体腔碱化剂）
 
  除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义RNA干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。
细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有：
  1.  观察自噬体的形成：
 
由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体（AV1）的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体（AV2）的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。
 
2.  在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成：
 
由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成，人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。
 
3.  利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成：

  自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。（Note：LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。方法2和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。）
 
4.  检测长寿蛋白的批量降解：非特异
 
5.  MDC（Monodansylcadaverine，单丹磺酰尸胺）染色：包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。
 
6.  CellTracker  Green染色：主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。在研究自噬相关蛋白时，需对其进行定位。由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切，为了区别，常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位：
  Lamp-2：溶酶体膜蛋白，可用于监测自噬体与溶酶体融合。
LysoTrackerTM  探针：有红或蓝色可选，显示所有酸性液泡。
  pDsRed2-mito：载体，转染后表达一个融合蛋白（红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号），可用来检测线粒体被自噬掉的程度（Mitophagy）。
  MitoTraker探针：特异性显示活的线粒体，荧光在经过固定后还能保留。
  Hsp60：定位与线粒体基质，细胞死亡时不会被释放。
Calreticulin（钙网织蛋白）：内质网腔
 
【Note：这些蛋白均为胞浆蛋白，爬片或胰酶消化的细胞在做免疫荧光前需先透膜（permeablize），可采用0.1%SDS处理】
 
  自噬与细胞死亡经常需一起考虑，下面介绍一些检测细胞死亡的方法： 
（1）△ψm dissipation（线粒体跨膜电位的消失）：TMRM发红色荧光，DiOC6 发绿色荧光。
（2）Phosphatidylserine Externalization（磷脂酰丝氨酸外翻）：Annexin 
V-FITC（绿色）染细胞膜，
（3）检测线粒体产生的ROS：无荧光的HE（hydroethidine，氢化乙啶）可被ROS氧化为  EthBr（ethidium bromide，溴乙啡啶），发红色荧光。NAO（nonyl acridine  orange，烷化吖啶橙，可发荧光）能与非氧化的cardiolipin（心磷脂，可被ROS氧化）反应而失去荧光。
（4）线粒体IMS蛋白的释放：AIF，细胞色素c，分别用荧光二抗染色。
（5）Capase 3a  染色：用荧光二抗染色，胞浆弥散分布。
（6）细胞膜完整性检测：DAPI（蓝色）、Hoechst  33342或PI（红色）染核。胞膜完整的细胞（活细胞和早中期凋亡细胞）排斥，可联用annexin V。
 
  如何用实验区分Cell death by autophagy和Cell death with autophagy 
第一步：利用上述方法证实细胞死亡
第二步：证实细胞死亡前发生了自噬
  第三步：在形态学上区别开“自噬样死亡”与凋亡
  第四步：利用遗传学手段（反义RNA干扰Knockdown掉Atg基因或hVps34）或工具药抑制自噬
  第五步：细胞存活则为Cell death by autophagy，反之，细胞死亡则为Cell death with autophagy。 

根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同，哺乳动物细胞自噬主要可分为三种方式 [Crotzer et al.,  2005]：大自噬（Macroautophagy）、微自噬（Microautophagy）和分子伴侣介导的自噬 
(Chaperone-mediated autophagy)。
  大自噬（Macroautophagy）即我们说的自噬（autophagy）
  微自噬（Microautophagy）：是指溶酶体主动、直接吞噬胞浆成分的一种方式。
分子伴侣介导的自噬  (Chaperone-mediated autophagy，CMA)：一些分子伴侣，如hsc70，能帮助未折叠蛋白转位入溶酶体。
  另外，几个与phage相关的概念：
吞噬（phagocytosis）：细胞主动吞掉胞外的细菌、碎片、或其它细胞。
  吞饮（pinocytosis）：胞外的液体
  异噬（heterophagy）：吞噬、吞饮的统称，强调所吞内容物来自细胞外，它们都是单层膜的液泡。
自噬体（autophagosome）形成后，可与吞噬泡或吞饮泡融合，然后再与溶酶体融合，但这一过程的证实还需更多的实验来支持。
 
自噬小体的增多有两种可能：一是形成增加即自噬被诱导；另外一种是自噬体成熟受抑即自噬体不能和溶酶体结合。该怎么来判断呢？另外，我们在神经系统中检测  LCⅡ，使用western  blotting，好像不怎么灵敏，还是因为它存在的时间较短？自噬体增多，也就是“自噬潮”出现的原因一是形成增多，二是与溶酶体融合受阻（如使用了氢化氯喹或氯喹，另外，溶酶体的酶抑制剂和质子泵抑制剂的使用亦有可能影响溶酶体与自噬体或异噬泡的融合），使自噬体不能降解而积聚，这种积聚造成的自噬体增多的效应要大于自噬体诱导剂效应的数倍之多。
  鉴于这样的原因，单纯的GFP-LC3荧光斑点增多不足以作为自噬激活的证据，可联用多个方法来判断：
  （1）加用自噬体与溶酶体融合的抑制剂，如氯喹，观察自噬潮的变化。
  （2）或加用LC3和溶酶体示踪物在荧光显微镜下观察共定位情况。
  （3）或Knockdown掉LAMP-2基因（溶酶体膜蛋白）。
（4）检测胞浆长寿蛋白的降解。
 
Western Blot检测LC3时除了上述的原因外，还有几个需考虑到的地方：
  （1）抗体的亲和力：有报道认为LC3抗体对II型LC3的亲和力较高
  （2）结合于自噬体内层膜的LC3-II在与溶酶体结合后被降解。
  （3）自噬过程很快，一个自噬体从产生到降解仅需2~3个小时或更短，其中自噬体形成阶段更迅速，数分钟即可完成，而溶酶体降解阶段耗时相对较长。因此，设置多个检测时间点（time frame）是非常重要的。
 
介绍一篇检测真核细胞细胞自噬的指导性文章，Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in  higher eukaryotes，Autophagy 4:2, 151-175; 16 February 2008。这是200多位细胞自噬的专家署名的文章，对检测细胞自噬绝对有用。而且这几年文章发展看来，想证明细胞自噬越来越难，需要的实验越来越多。
 
自噬现在作为细胞研究的热点领域，自然与其特殊的作用有关，但不能把其作为解决以前不能解决之问题的“万金油”，这一倾向在发现凋亡、miRNA后出现过。
 
我们有时候需要跳出这个圈子来看圈子里的问题。当细胞所处的环境发生改变时会发生什么样的反应？
（1）适应：通过内部的调整，达到一个新的平衡点，继续存活。
（2）不适应：通过内部的调整，无法平衡，死亡。
 
  问题来了，怎么死的？因为现在人们可以观察到至少3种死亡方式：坏死、凋亡、自噬样死亡。死了就死了，分那么多方式干吗？我想，有必要分清楚这3种死亡方式的不同和好处：
  坏死一般认为是刺激过于 剧烈，细胞没时间也没法修复，被动死亡，内容物释放。
 
凋亡是众所周知的主动的、不可逆的死亡，个人认为
（1）引起凋亡的刺激与引起坏死的刺激在强度上应该弱一点。

（2） “主动”的意思就是死了比活着好。对谁好（有利）呢？凋亡细胞自己已经死了，那么只可能是周围的细胞了。确实如此，凋亡时细胞被“切碎”，里面的成分纷纷变成了熟的“易消化”的食物，以方便周围细胞易摄取。因此，凋亡应该是一个群体水平的概念，是群体应对不利因素时依靠牺牲部分个体来维持群体继续存活的机制。
 
自噬样死亡到目前为止还只是一种现象，因为我们只知道细胞自噬样死亡时胞浆中存在大量液泡，且在形态学上与凋亡有一定的区别，而对自噬与死亡的因果关系尚不清楚，更不知道它对群体有什么好处、与凋亡相比刺激信号有什么不同。就目前的研究进展来说，自噬是肯定的，鉴定和监测方法也较成熟，但自噬样死亡是模糊，鉴定比较困难，且尚需生理情况下和临床的研究证据来支持。
 
不肯定的、模糊的地方也就是值得研究和探讨的地方，大致有：
  （1）继续进行自噬相关蛋白的鉴定及功能研究（不应局限于自噬）
  （2）自噬过程本身的机制研究（比如捕获胞浆成分的特异性问题、膜的发生、自噬相关蛋白的转位及组装）
  （3）自噬的调控（包括自噬激活信号到beclin-1之间的传递通路及相关调控蛋白的鉴定、自噬固有过程本身的调控）
（4）明确自噬与细胞存活、死亡的关系（是属于内部调整的范畴还是细胞命运的结局？）当这些基础性研究完成了，应用性研究的前景才会明朗。