手把手教你使用图像分析软件Image-pro Plus （4）

前面十讲见这里：手把手教你使用图像分析软件Image-pro Plus （1）
手把手教你使用图像分析软件Image-pro Plus （2）
手把手教你使用图像分析软件Image-pro Plus （3）

第十一讲：免疫组化光密度测定方法
以前的帖子更多的是讨论IPP的操作方法，对实际应用说得较少，最近作了很多免疫组化的图象分析，总结一下分析方法。希望对其他使用的同学们有点用处。另有一个关于免疫组化图片分析方法的教学PPT，可以看看。（在下面附件里）

我这里说的免疫组化图片，是这样的一类图片：染上的颜色是黄色，如果染得浓，就呈现棕黄色。（制作样品的过程可别问我。我不知道）

要 比较不同切片的光密度值来确定它们之间的蛋白表达的差异，首先要注意的就是这些切片样品要用尽可能完全一致的方法来处理。最近看到一个新技术挺不错，就是 把各个样品定位后，各切出一个小细条，整整齐齐排成一个阵列，包埋在蜡块中，切成一片切片，然后进行免疫组化反应及染色处理。这样在一个载玻片上就有了数 百个小切片，不仅它的的切片染色条件一致，还节省了抗体试剂。

切片当然首先得拍成照片才能进行分析。拍照也是一个重要环节，在显微镜下拍摄免疫组化照片需要注意以下几个要点：
1. 所有照片必须在完全同样的显微镜条件下拍摄，在更换样品时，除了调整焦距和视野外，显微镜上的其他部件都不能动！所有的样品必须一次拍摄完全。特别是在拍 摄过程中，不要一会用高倍镜，一会用低倍镜，来回切换物镜。当然，在使用高倍镜时对焦及寻找视野会稍麻烦一点，但也没办法。保持各张切片的拍摄条件一致更 重要。
2.数码相机必须设置为手动曝光，并且保持每张照片用同样的曝光条件，同样的曝光时间，同样的光圈。特别要注意的是，一定要将数码相机的自动白平衡功能给关掉！！！
3. 免疫组化切片一般染色不太深，因此拍摄出的照片颜色较浅，就让它浅。拍摄出的照片中空白部位应尽可能呈现纯白色。测量其灰度应在230-240之间。如果 呈现淡蓝色，一般是相机自动白平衡在起作用。另外一个因素是显微镜灯光电压不正确。要使灯光本身的色温正确。既不偏黄，也不偏蓝。下面两张照片中左边一张 是合适的曝光，右边那张不好。

打开要分析的图片后首先要进行光密度校正。
点开intensity calibration窗口后，选std option density，并点option按纽，在弹出的窗口里点insident旁边的image按纽。弹出第三个窗口后，将鼠标移到图片的空白处点一下，就可 以看到current value的值会显示出点击部位的灰度值。白色的背景能达到250左右，而拍得较暗的照片或者背景偏蓝的照片则只有200甚至更低。
一张照片的背景强度不会是完全一样的。所以要在照片各个不同的空白处都点一下，看看它们的值差别大不大。许多相机拍的显微镜照片是中间稍亮，四周暗。所以最后确定的背景值只能是取它们的折中。
较正背景的值会在曲线的X轴端中表现出来。

光密度校正窗口可以放在屏幕上随时检查，有时候在切换了图片后其光密度校正值会有变化。

现在可以调出count/size窗口，先选择测量项目，前面说过density mean是不合适的测量参数，IOD也有点误差，不过这是系统误差，对半定量分析的影响不大。所以可以选用IOD与area两个测量项目。当然把选中区域转换成灰度图片再测量更好。
另外对option也要适当设置一下。

然后要保存count/size窗口的设置，点count/size窗口的 file -- save settings，将当前的测量设置文件保存，最好与图片文件存在同一个文件夹里，免得以后找不到。文件扩展名是 .env 。保存这个文件的目的是为了制作宏操作用的。

下面就可以选择颜色了，点select colors ,取HSI颜色系统，S与I都选0到255，H选0到30左右。这基本上包括了黄色区域。

然后也要保存颜色设置文件。

下面就可以测量光密度值了，点count，然后到statistics窗口中查看测量值。
IOD SUM 与area SUM是有意义的测量值。IOD SUM是图片中黄色区域的累积光密度，area SUM则是选中的黄色区域的面积。

如果想要测准一点，就需要把选中区域复制下来，再转换成灰度图片后再测量光密度。作法如下：
1.选好颜色区域后，在preview中选 transparent on white，这时图片中未被选中的区域都被填上了白色。再点create preview image按纽，就生成了一张新图片，再用edit -- convert -- grey scale 8把这张图片转换成八位灰度图片。
2. 重新校正光密度，依然把insitent level定为250。这实际上就是扣背景了。

3.对灰度图片，select color按纽变成了select range。点出的选色窗口只有一个强度范围，要选择0到255。整个照片都选上，当然，选0到250也行，没选上的都是白色区域，测量没有影响。

4.回去点count按纽，到statistics窗口里察看测量值。IOD的确与上面所作的不同。area也稍有差异，当属复制图片引入的误差。

下面就是统计问题了。现在我们测量的是整张照片中黄色区域的总光密度值。图片与图片之间是否就是比较它们之间的IOD值呢？未必。

最简单的情况是，切片充满整个视野，并没有大片空白。此时IOD值就能反映出这两张图片染色程度的不同。实际上这些照片的测量区域面积都是整张图片（不是黄色区域的面积），其平均光密度就是IOD除以图片的整个面积。实际上比较的就是整个视野的平均光密度。

另一种情况是照片上有空白区域，是没有组织的空白。因此在计算平均光密度时要把这部分面积给扣掉。使用的测量指标应该是切片的平均光密度，计算方法为
IOD/（照片面积-空白区域面积）

照片面积就是照片的象素，一张480*720象素的照片面积是345600。
空 白区域面积得另测一下，选色时把 I 选在250-255之间，H选30-255，再count一下就能测出了。不过这样测有时会把组织内部的小空泡也选进去。这只要在面积测量中设一个大一点 的过滤值就行，比如只计算面积大于200象素的区域。还可以看measurement date ,找那个最大的几个object的面积。

如果视野内还有不同类型的组织区域，不应被计算进去，可以用不规则曲线工具选中这些区域，用edit -- filled 把它们填上白色。再进行测量。

还有其他的一些复杂情况，没法一一叙述。一句话，测量的IOD是分子的值，一般情况下都相似，选择的area这个分母在不同的切片上却各有不同，需要看切片的具体情况进行适当选择。本质上比较的指标应该是一个平均光密度（IOD/area）。

当切片较多时，制作一个宏操作能大大省时省力。