长链非编码RNA（LncRNA）的研究策略

对miRNA这一“富矿”的开发吸引了许多目光，也引起了不少生命科学工作者对ncRNA的兴趣。“小”RNA的研究已结出了累累硕果，“大”RNA的世界里，又有什么宝藏呢？众所周知，lncRNA淘金热，也来了。

长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)指的是长度超过200nt的RNA分子。它们不编码蛋白，位于细胞核或胞质内。lncRNA最开始在一项对小鼠cDNA文库的大规模测序中被揭示。随着微 阵列和新一代测序等高通量技术的发展，越来越多的lncRNA被发现。有关lncRNA的报道快速增长。研究显示，lncRNA并非以前所认识的那样没有功能。它们在多种层面上（如表观遗传学、转录调控及转录后调控等）调控基因的表达水平。其功能涉及到许多方面，如参与X染色体的失活，调控mRNA的降解，构成细胞核亚结构的骨架，作为染色质重塑的调控因子等。目前研究数据呈爆炸性增长，尽管对于大量的lncRNA的功能以及它们行使功能的过程等信息人们知之甚少，但人们已经认识到，lncRNA是个待开发的“富矿”。

lncRNA已经成为基因组研究的热点之一。一些富有意义的研究成果已出现，这些成果带给研究者更多的兴趣和更多的思考。称其为“富矿”不为偏颇。然而， 也有许多问题摆在人们面前。许多lncRNA的生物学功能未得到的阐明。 如何区分功能性和非功能性非编码转录物依然不易；lncRNA作用机制多样、复杂，不同的lncRNA研究结果之间的借鉴意义不高。用于lncRNA研究 的新技术不多, 需要建立更多、更有效的研究方法用于系统地研究lncRNA的结构和功能。譬如，高分辨率的活体成像技术、高通量的蛋白质检测技术、高灵敏的lncRNA 检测技术和高效预测lncRNA二级结构和靶标的生物信息学技术等。

随着越来越多的研究者关注并且投身到lncRNA研究领域中, 对lncRNA的知识积累也越来越多，人们对其认识必将越来越深入。对复杂神秘的lncRNA世界的探索不易的，但“探宝”之旅必将是富有收获的。

与miRNA的研究类似，发现新的lncRNA 是lncRNA创新研究的一个方面。发现lncRNA，主要依赖于两种技术：微阵列技术和核酸测序技术，尤其是新一代测序技术。

传统的微阵列技术多用于检测mRNA的丰度，不用于lncRNA的检测。但有研究显示，有些原来被认定的mRNA实际上是lncRNA；有的lncRNA 有polyA尾巴，有的则没有。因此，一部分微阵列检测的数据包含有部分lncRNA的信息，可以重新对数据进行分析、注释，获取这部分lncRNA 信息。随着越来越多的lncRNA被发现，专门的针对lncRNA芯片被设计开发出来，可以利用相对保守的区域作为探针发现新的lncRNA。然而，一部 分lncRNA表达水平很低，不易被芯片检出。另外，SAGE（serial analysis of gene expression）实验的结果可用于lncRNA研究。挖掘EST(expressed sequence tag)公共数据库也可发现一些候选的lncRNA。对cDNA进行克隆、全长测序的方法曾发现一些lncRNA，如FANTOM（Functional Annotation of The Mammalian Genome）项目的一些工作。

新一代测序技术在lncRNA研究中应用广泛、作用巨大。一种直接的方法是RNA-seq，它可以检出低丰度转录本，可直接、快速发现新转录本，包括新 lncRNA。除RNA-seq外，对用其它方式捕获的RNA甚至DNA进行新一代测序，不但能够发现新的lncRNA，还可推断其功能或调控信息。

用新一代测序技术发现lncRNA，强烈依赖于计算机进行数据的处理和分析。

计算机对lncRNA的识别考虑了多种因素。有的因素很明显，如转录本总长需大于200nt；不编码任何已知蛋白质或其区段，这是由lncRNA的定义决定的。另外的因素还有ORF（Open Reading Frame）长度和序列及二级结构的保守性等。

从概率上讲，如果一个转录本不编码蛋白，其起始密码和终止密码的分布是趋于随机的，ORF 一般不会超过300 碱基或100氨基酸残基。这种方法也有例外。一些lncRNA如Xist有大于300nt的ORF，而拟南芥中的RCI2A基因只编码54个氨基酸。为了 避免误判，有人对ORF策略又添加了更严格的条件，如用基因组数据库做比较基因组学的检验，蛋白同源区长度不能超过30个氨基酸。

一般来说，mRNA 的ORF是具有保守性的，即可编码蛋白质的转录本序列与已注释的蛋白质或蛋白质结构域有同源相似性。可将预测转录本的氨基酸序列放入蛋白质库进行搜索，最 后根据比对得到的同源相似性得分来判别该转录本是否可能编码蛋白质。该方法的缺点在于它们依赖于现有蛋白质库的准确性，另外有些lncRNA系mRNA演 变而来，也会表现出与已有蛋白质的同源性，可被错判为mRNA。其它一些指标，如密码子替换频率（Codon Substitution Frequency, CSF），被一些程序用来考量转录本。非编码序列较编码序列缺乏保守性，易发生突变，CSF高。 有一些lncRNA的二级结构具有一定的保守性，有些程序依据这些结构特性进行lncRNA预测，但某些mRNA也有类似的保守性，可能会误判。

有些软件通过整合许多因素来预测lncRNA。譬如机器学习的方法，通过学习序列、结构和表达等多种特征，建立分类模型（训练集），进而进行新的 lncRNA的预测。有些整合的方法，没有机器学习的过程，但将多种特征作为过滤标准，判定某转录本是否为lncRNA。这种方法，因筛选标准多，可产生 假阴性。

lncRNA的功能研究

与miRNA只含有二十多个核苷酸不同， lncRNA较长，承载的信息量多，更容易形成高级结构，因此，lncRNA的功能具有多样化和特异性强的特点。对其功能的探索也采取了多种方式。

类似于miRNA，探讨lncRNA功能可用 gain/loss of function 策略。过表达或沉默lncRNA后观察表型。在构建lncRNA表达质粒时，需关注lncRNA是否在蛋白编码基因的启动子区域或3’-UTR区域，勿遗 漏重要区段； 也可用siRNA等方法沉默lncRNA，经qRT-PCR或FISH等验证后观察其对疾病相关基因表达和对细胞表型等的影响。实际上，对基因表达或细胞 表型的观察也不是任意或无目标的。基于该lncRNA的GO分析等生物信息学手段有助于缩小观察范围。

近年来出现一种非编码RNA沉默与定位分析(Combined knockdown and localization analysis of noncoding RNAs, c-KLAN)技术，用于对lncRNA进行功能缺失研究和细胞定位。该技术针对目的lncRNA设计引物，将其逆转录成cDNA, PCR扩增cDNA， 此后，一方面对扩增产物进行体外转录, 生成dsRNA，用核糖核酸内切酶Ⅲ酶切dsRNA来制备esiRNA (endoribonuclease-prepared siRNA)，用于对lncRNA进行功能缺失研究；另一方面用荧光标记的UTP对扩增产物进行体外转录，以制备正义或反义的FISH探针，用于对 lncRNA进行定位分析。

lncRNA可与蛋白质、DNA和RNA相互作用，实现多样化功能。因此，可通过与其互作的分子探讨其功能与作用机制。通过互作的蛋白质研究lncRNA 的方法如RIP（RNA-immunoprecipatation）技术，包括化学交联RIP、nRIP(native RIP)和CLIP（UV-crosslinked immunoprecipatation）。它是通过特异的抗体结合核蛋白复合物捕获与lncRNA的。它可与新一代测序技术结合。RIP-Seq和 CLIP-Seq(又称HITS-CLIP)可用于lncRNA筛选和功能研究。通过lncRNA与DNA相互作用的检测方法有 ChIRP（Chromatin isolation by RNA purification）、CHART（capture hybridization of RNA target）和ChRIP（chromatin RNA immunoprecipatation）等。由于lncRNA可通过形成二级或三级结构行使功能， 可采用RNase footprinting，Chemical Mapping，in-line Probing和SHAPE（selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension）等技术研究其功能域。

生物信息学方法预测lncRNA的功能始终是一个吸引人的研究方向。在正确预测的基础上进行功能研究可节省时间，少走弯路。因为lncRNA保守性差,对其功能预测难度不小。有以下几种策略。

比较基因组学策略。尽管大部分lncRNA一级和二级结构不保守，仍有小部分是保守的。根据结构保守性可推测功能相似性；

与编码基因进行共表达分析。这是一种应用较广的策略。lncRNA可通过与蛋白的作用行使功能，提示可通过它与mRNA的共表达分析预测其功能。适用于基因组水平的分析。数据来源多为微阵列或高通量测序结果；

通过与miRNA或蛋白的相互作用预测。有些lncRNA的功能与miRNA有关。因此,可通过miRNA推测lncRNA的功能。一些算法如 miRcode已提出。另一方面,也可通过评估其潜在的互作蛋白推测其功能。一种在线算法catRAPID可用于预测RNA与蛋白质的相互作用。该算法根 据RNA和蛋白质的物理化学性质如二级结构、氢键和范德华力等来评估它们之间相互作用的倾向。这种策略只对部分lncRNA适用。

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lncRNA的高通量研究方法

lncRNA的高通量研究方法，主要是微阵列和新一代高通量测序。它们在大规模发现lncRNA和探索lncRNA的功能中得到应用。

用前述RIP 或CLIP等实验方法得到的RNA或直接抽提得到的总RNA可用于微阵列芯片或新一代测序方法检测lncRNA。微阵列芯片检测包含随机引物标记、杂交、洗涤、染色、扫描、图像采集和数据分析等流程。该法准确高效快捷。

新一代测序方法在lncRNA研究中有重要作用。以起始材料为总RNA为例，其检测lncRNA的流程示意如下。

lncRNA高通量研究结果的验证

Northern blot可直接检测目的lncRNA存在与否以及它在不同组织、器官、发育阶段、环境压力以及处理前后或处理过程中的表达模式，是一种经典的手段，实验过程较烦琐。

qRT-PCR是较常用的验证办法。实验过程简便，灵敏度高。可用Taqman探针或SYBR Green法检测多个或单个lncRNA的表达水平。

FISH(Fluorescence in situ hybridization)可用于检测DNA或RNA并对其进行定位。RNA-FISH可对组织切片、细胞涂片等材料中的lncRNA进行定性、定位和相对定量研究,也是一种较常用的lncRNA验证方法。

对多基因大样本进行验证时，可利用Panomics QuantiGene Plex 技术，同时对3-80个lncRNA进行大样本验证。这种技术适合微量样本做多基因检测。实验无需抽提纯化RNA，直接定量来源于培养细胞、全血或组织等 样本中的lncRNA，也无需反转录及PCR.

有的lncRNA的表达非常低，可用Panomics ViewRNA原位检测技术进行单个lncRNA的表达水平、分布以及与潜在靶基因表达的相关性研究。该方法便捷灵敏,适合细胞、血液和FFPE样本等。

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lncRNA 芯片研究概述

1. 归一化

lncRNA芯片采用的归一化的方法为quantile normalization。

2. 差异LncRNA的筛选

lncRNA芯片中既有lncRNA的探针又有mRNA的探针，分别做差异基因的筛选，筛选方法同表达谱的筛选方法是一致的，参见表达谱的差异基因筛选。

3. 差异lncRNA的重注释

lncRNA芯片注释不完善，因此需要将筛选出来的lncRNA进行重注释。将差异lncRNA在基因组上位置上下游延伸，以寻找lncRNA附近的有功能的基因。

差异lncRNA重注释示例

4. 差异lncRNA靶基因的预测

lncRNA可能通过调控相应的mRNA发挥功能，因此有必要预测lncRNA的靶基因。我们提取差异lncRNA和mRNA的序列，首先用blast进行初筛，之后用RNAplex进行进一步筛选，以预测lncRNA可能调控的mRNA。

差异lncRNA靶基因预测结果示例

5. 差异lncRNA与靶基因共表达网络

预测出lncRNA的靶基因后，并可进一步在mRNA的数据中探寻该mRNA是否发生表达量的变化。由此构建差异lncRNA与靶基因相互作用网络图。

差异lncRNA与靶基因相互作用网络图。方框代表lncRNA，圆形代表mRNA。连线表示可能的调控关系。节点面积越大，表示调控的mRNA越多，预示该lncRNA在调控网络中所起的作用可能越大。

6. 差异lncRNA与差异mRNA的共表达分析

SBC Human lncRNA芯片能同时检测出差异表达的lncRNA和mRNA。我们将差异lncRNA和差异mRNA在一组样品中进行共表达分析，可以发现与某个lncRNA具有相同表达模式的mRNA。

要求：每组数据3个或3个以上生物学重复

实验组：

对照组：

lncRNA与mRNA共表达分析作用图，圆形带圈代表lncRNA，圆形代表mRNA。红色为上调基因，绿色为下调基因。

7. 差异lncRNA靶基因的GO analysis

对lncRNA的靶基因进行GO Ontology的生物学的分类，根据Fisher's Exact Test,得到p-value，得到lncRNA靶基因对应的显著性功能，从而了解lncRNA的功能。

8. 差异lncRNA靶基因的pathway analysis

对lncRNA靶基因按照Pathway的主要公共数据库KEGG和Biocarta来进行分类，对Pathway中的基因进行基于离散分布的显著性分析，得到与实验目的有显著联系的Pathway 分类,由这些pathway对应相应的靶基因，从而获得该分类即导致lncRNA差异的最重要Pathway。

9. 差异lncRNA的转录因子的预测