新冠核酸提取效率比对及影响因素探讨

2022-01-22 robot 网络

实时荧光定量 PCR 检测技术具有特异性强、灵敏度高、稳定性好等优点,但影响其检测效果的因素有很多,除引物序列、反应体系、扩增条件等,病毒 RNA 的提取效率也十分关键

作者:同济大学附属东方医院胶州医院---王晓燕,滕一明

 

实时荧光定量 PCR 检测技术具有特异性强、灵敏度高、稳定性好等优点,但影响其检测效果的因素有很多,除引物序列、反应体系、扩增条件等,病毒 RNA 的提取效率也十分关键[1]。在建立核酸检测方法或开展相关的检测实验过程中,试验人员往往更关注于对检测方法的优化,而检测方法的上游试验-核酸提取对于最终检测结果的影响往往容易被忽视,核酸提取试剂盒提取效率比对的相关研究相对较少[2]

下面,我们就本实验室的两套提取系统,通过RT-PCR的CT值,进行提取效率的比对,并探讨其影响因素。首先,进行磁珠法核酸提取原理的图示:

 

磁珠法核酸提取原理

实验室检测系统及RT-PCR的CT均值

比对结果

从上表CT均值看出,中元提取系统对于ORF1ab目的基因片段的提取效率更高,之江提取系统对于N目的基因片段的提取效率更高。

结果分析及影响因素探讨

2020年3月31日,国家药品监督管理局发布了中华人民共和国医药行业标准(YY/T 1717--2020)--核酸提取试剂盒(磁珠法),于2021年4月1日开始实施。该行业标准详细描述了提取产量(yield)、核酸纯度(purity of nucleic acid)、精密度(precision)的概念和具体要求。

其中5.5部分:提取效率应符合生产企业规定的提取效率要求。生产企业应规定提取效率的检测方法。提取效率又称回收率,从样本中提取到的核酸占该样本中总核酸的比例,通常为90%-110%。

《临床分子生物学检验》第3版指出:分析中质量管理包括核酸提取、扩增和产物分析等环节。从提取原理和流程来看,核酸提取的影响因素包括裂解、洗涤、洗脱三部分。

1.裂解:裂解液的主要成分是异硫氰酸胍和苯酚,适用于从细胞和组织中快速分离RNA。异硫氰酸胍是一类强力的蛋白质变性剂,可裂解细胞,使细胞中蛋白质变性,核酸释放。此外提取试剂中加入8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源性和外源性RNA酶,可有效提高提取效率。

2.洗涤:RNA和DNA在一定PH条件下溶解度和变性程度存在差异,因此需要在不同的PH环境下分离纯化。酸性条件下(PH4.5-5.5)RNA分子则分布在水相中,有利于RNA的提取和纯化。

3.洗脱:磁珠法采用的是纳米级磁珠微粒,并在磁珠表面标记了一种活性基团,能与核酸发生吸附反应,在磁场条件下发生聚集或分散,从而进行核酸的洗脱。因此,磁珠的超顺磁性程度是影响核酸提取效率的直接因素。

由于自动化提取核酸具有处理样品大、操作时间短、标准化、质量控制易行等优势,能保证临床检测结果的可靠性和重复性,同时又可把生物安全风险和样本间交叉污染的风险降到最低,因此,已经成为临床核酸提取的发展方向,应用越来越广泛。自动化提取核酸纯度可达到95%-99%,操作时间9-45分钟,提取过程规范化,减少了人为误差,推动了临床生物学检测技术的发展[3]

 

参考文献

[1]桂 飞,杨伟伟,俞利平等,六种核酸提取试剂盒对粪样中小鼠肝炎病毒核酸提取效率的比较[J]实验动物科学,2019,36(1):31-34

[2]董浩,韩焘,毕一鸣,原霖等,6种核酸提取试剂盒的布鲁氏菌核酸提取效率比较[J]中国动物检疫,2020,37(6):81-85

[3]童建华,娄加陶,刘湘帆,《临床检验 一万个为什么 分子生物学检验分册》2018年5月第一版

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  1. 2022-01-23 屋顶瞄爱赏月

    好好学习

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  2. 2022-01-23 查查佳佳

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