浅谈T细胞分选在CAR-T细胞制备中的应用及未来发展趋势
2022-09-08 上海细胞治疗工程技术研究中心 上海细胞治疗工程技术研究中心
针对T细胞的分选一是，包括有CD4/CD8的分选或CD3的分选，联合后续纳米级别的CD3/CD28抗体激活试剂；二是以微米级别磁珠直接偶联CD3/CD28抗体对T细胞进行分选及激活。
磁珠分选的细胞治疗中重要性
自从Emily Whitehead带来癌症治愈新希望后，CAR-T细胞疗法再次稳固了它免疫细胞疗法领域的中心地位。继诺华的CTL019之后，FDA在2017年公布Kite公司的Yescarta CAR-T免疫细胞疗法成为FDA认证的第二个细胞治疗药物，目前FDA已经批准的CAR-T产品有6款。随着全球范围内生物细胞技术和产业快速发展，细胞治疗及临床转化成为我国健康保障发展的重大课题，国内企业也在迅猛发展。
尽管近两年细胞治疗产品的细胞来源和种类不断丰富，针对T细胞进行改造的细胞疗法目前仍占据整个细胞治疗行业的重要部分。而CAR-T细胞产品的制备流程十分复杂，涉及到单采采集，T细胞细胞分选激活，基因修饰，扩增培养，收获冻存等多个步骤。其中T细胞的分选和激活是非常关键的一个工艺环节，关系着后续是否成功制备细胞产品。
▲ 图 1 CAR-T细胞疗法生产工艺流程概览
越来越多的文献表明，T细胞分选在CAR-T细胞制备中非常重要，直接影响到CAR-T细胞的抗肿瘤活性。Juno的早期创始人Stanley R. Riddell曾发表报道：CD19 CAR–T cells of defined CD4+:CD8+ composition in adult B cell ALL patients（ClinicalTrials.gov #NCT01865617）。文章主要介绍了限定比例的CD19-CAR T细胞在29例难治/复发急性B淋巴细胞白血病患者中的临床治疗效果，其中27例（93%）患者实现了骨髓水平的缓解。他指出：“与来自未分选的T细胞相比，有特定亚群的T细胞产生的CAR-T细胞产品具有更好的抗肿瘤效应。“在2017年CDE发布的《嵌合抗原受体修饰T细胞（CAR-T）制剂制备质量管理规范》中也明确建议：”对采集的外周血进行单个核细胞的分离及T细胞的分化，并对所分选出的T细胞进行刺激和活化。”进行T细胞分选可以带来如下好处：
T细胞主要分选策略及产品
目前针对T细胞的分选及激活主要有2种策略。一是以纳米级别磁珠为基础的分选，主要策略包括有CD4/CD8的分选或CD3的分选，联合后续纳米级别的CD3/CD28抗体激活试剂；二是以微米级别磁珠直接偶联CD3/CD28抗体对T细胞进行分选及激活。
市场上纳米级别磁珠的大小在50-500nm之间，分为有柱式分选和无柱式分选。无柱式分选操作简单快捷，无需负担分选柱的耗材成本。无柱式分选的纳米级别磁珠大小在200-500nm，由于纳米级别磁珠的磁力作用相对较弱，需要添加大量的磁珠抗体与细胞表面抗原结合，细胞才能被磁铁吸附从而被分选出来。而过量的磁珠抗体标记可能对细胞的信号通路产生激活从而影响细胞功能，因此无柱式分选往往应用于阴性分选，即磁珠标记非目的细胞，通过磁分的方式将非目的细胞去除。另一方面，无柱式分选操作中存在开放操作步骤，如需应用到GMP生产，需要在A级环境进行操作。而有柱式分选，可通过分选柱结构有效增大磁场强度梯度，磁珠大小在50-100nm之间，少量的磁珠标记，细胞就可被分选出来，且无需对磁珠进行去除。借助于分选柱的密闭结构，可将整个磁珠分选的步骤在全密闭的自动化系统中完成，这也是目前CGT行业进行细胞分选的金标准之一。以CliniMACS Plus为代表的临床级别自动化磁分设备广泛应用于细胞治疗领域。
T细胞的另一种激活分选策略则采用微米级别磁珠直接偶联CD3/CD28抗体。以Dynabeads:trade_mark:为代表的4.5μm级别的激活磁珠也是目前T细胞激活的另一主流产品。微米级别磁珠具有更强的结合能力，更强的激活效果，可将T细胞的分选及激活步骤整合。且微米级别磁珠无需分选柱结构即可完成分选，节省了分选柱的耗材成本。但监管法规要求对微米级别磁珠在最终产品的残留进行检测，并达到相应标准，因此需要对激活扩增后的细胞进行磁珠去除的操作。CTS:trade_mark: DynaMag:trade_mark: Magnet磁力架可对Dynabeads:trade_mark:结合的细胞进行分选，并对培养后的细胞进行磁珠去除。整个操作流程可在全密闭的管路及袋子中完成，但需要手动调整磁铁的角度，控制液流速度，从而达到最佳的分选或去除效果。
工艺放大及商业化的挑战
我国的细胞治疗研发水平现在与国际处在同一水平线，CDE不断颁布新的法规及指导原则，对细胞治疗工艺的规范化也提出了越来越高的要求。除了全封闭工艺流程外，细胞治疗产品的商业化工艺开发，急需自动化，生产流程可追溯性的设备。特别是随着国际形式的不断变化以及疫情影响，进口设备及试剂耗材存在到货周期长，甚至断货的情况，且价格昂贵，对国内的细胞治疗行业发展产生了阻力。因此越来越多的细胞治疗客户在寻找国产化的替代方案。作为整个CAR-T细胞产品制备的第一个重要环节，磁珠分选及激活在后续制备成功率中发挥着关键性的角色。国内众多厂家已经开始布局磁珠抗体产品，但针对微米级别磁珠的去除，还没有自动化的设备方案。
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