Nucleic Acids Res ：为拯救妻子，他转行病毒学！发顶刊探索治疗阮病毒的新方法

麻省理工和哈佛大学Bord研究所的科学家们发现了一种可能会治疗阮病毒的新方法，这一工作发表在《NucleicAcids Research》上，值得一提的是，通讯作者Sonia M Vallabh与Eric Minikel是一对夫妻。

在这对夫妇相识之前，Minikel是一位城市规划建筑师，在2011年12月他27岁时，他仍然在MIT的校园里像一位普通的大学生一样在进行城市设计和规划方面的博士研究。

然而很快他得到了一个坏消息，他一生的挚爱Sonia Vallabh，经测试呈阳性（PRNP D178N）突变，该突变可导致遗传性朊病毒病，并于一年前夺走了Sonia母亲的生命。Sonia当时27岁。平均发病年龄为50岁左右，而且该突变具有很高的遗传性，这意味着除非找到治疗或治愈方法，否则她极有可能患上这种疾病。

Minikel意识到，自己要去拯救Sonia，然后他们开始在夜间业余学习病毒学知识。他们利用夜间时间阅读论文与其他的科学家联系，参加会议。

最终他们都离开了之前的研究方向，取得了哈佛大学医学院博士学位。在那里他们开始追逐曾经对于他们不可实现的梦想—每天醒来并肩奋斗与发现治疗Sonia的方法，至今已经九年。

他们开通了一个博客用来科普相关病毒学知识，在2013年他们共同获得了博士学位之后，这个博客得到了来自社会的捐款，每笔社会的捐款都被用于在Bord研究所进行阮病毒的研究。

令人欢呼雀跃的是，在疫情中，他们在2020年3月20日迎来了一个新的男婴Kavari Minikel Vallabh。像他的大姐姐达鲁卡（Daruka）一样，卡瓦里（Kavari）也走了很长一段路：他通过IVF-PGD出生，以确保他不会遗传Sonia的朊病毒遗传突变。Daruka已经十六岁，是个非常健康的孩子。

研究背景

朊病毒病是一种致命的，目前无法治愈的神经退行性疾病。这种病非常罕见，但通常会引起快速的神经变性。美国每年报告约300例阮病毒病。影响人类的阮病毒疾病最常见的是克雅氏病。牛海绵状脑病，通常称为疯牛病。阮病毒疾病是由于破坏正常人类大脑病毒蛋白质的结构而引起的，在大脑中产生了有毒的团块。由于病毒蛋白对疾病至关重要，因此降低患者体内病毒蛋白的水平是一种很有前途的治疗方法。

降低大脑中的朊病毒量表达是治疗朊病毒病毒病的一种假说，研究最近表明，在预防性和延迟给药范例中，在脑内感染阮病毒的小鼠中，反义寡核苷酸（ASO）介导的PrP抑制作用延长了生存期并延迟了疾病的发作。在这里，研究了这种治疗方法在各种范式，改变剂量和给药方案，病毒株，治疗时间点以及检查症状，生存率和生物标志物读数方面的功效。用其他靶向PrP的ASO综合以前的研究的发现，并证明了对另外四种病毒株的治疗效果。

研究详情

该研究证明了<25％的PrP抑制作用足以延长生存期并延迟预防范式中的症状。在检测到病理变化后，通过单剂量降低PrP的ASO可以逆转神经炎症和神经元损伤标志物的升高。慢性ASO介导的PrP抑制可在任何时候开始直至神经病理学的早期征兆，其益处类似于组成型杂合PrP敲除。

人们已经考虑使用治疗性寡核苷酸通过靶向其RNA来降低PrP（19），但是在动物模型中，由于药物传递和分布挑战而受阻的早期尝试并未产生任何效果，被设计用于降低其他单个靶蛋白水平的基因靶向疗法最近显示出有希望的靶标参与人类中枢神经系统的活动。Sonia等发现在脑脊液（CSF）中推注降低PrP的反义寡核苷酸（ASO）可以使感染病毒的小鼠的生存期延长61–98％。尽管杂合敲除动物对减少50％的PrP表现出明显的对照，但尚未确定赋予受益所需的最小PrP敲除阈值。尽管之前的实验表明，经ASO处理的动物脑组织病理变化延迟出现但并未研究对治疗后已确立的神经病理变化的潜在影响。

通过对HEPA1-6细胞中约500种ASO进行细胞筛选，强大的ASO随后接受四点剂量反应实验。最后，C57BL / 6N小鼠接受推注剂量的活性ASO 1和2以表征体内效价为了产生具有10个碱基的对称对称侧接2'O-甲氧基乙基（MOE）修饰核苷酸的ASO，围绕ASO 1和2个活性位点进行了优化。小鼠随后接受700μg剂量的五种新候选ASO之一，其通过单次大剂量脑室内注射（ICV）来递送。八周后，通过qPCR对皮层和胸部的Prnp mRNA抑制进行了定量。结合每周动物体重和神经系统检查数据，这些数据可确定ASO 5和6的优先级。表1显示了所有ASO的化学修饰。

ASO是由糖，主链和其他化学修饰物的各种组合合成。先前已证明具有两种化学制剂的三种PrP靶向序列可保护受到病毒感染的小鼠。使用ASOs 1和2以及化学匹配的非靶向对照的体内研究证实了体内靶RNA和蛋白质的减少，并且表明降低RNA才能对感染阮病毒的小鼠产生有益的作用，这表明寡核苷酸通过RNase-H介导的机制起作用。

对活性ASO 1和2的结合位点进行了优化，以设计和合成一组具有混合PS / PO主链和10个碱基的脱氧核苷酸缺口的ASO。给药后八周的监测中，每周的神经系统检查均未发现任何结果，行为观察和体重增加轨迹可与生理盐水对照组动物相媲美。选定的化合物（ASO 5和6）达到了与先前报道的相似的靶标结合水平，其中活性序列在500μg剂量后一周内将皮质PrP RNA降低了约一半，新设计的化合物显示出相当的作用时间。与对照组相比，症状终点分别延迟了108％和80％。这些靶向PrP的ASOs延迟了疾病的发作，这反映在治疗动物的体重减轻和症状累积上，对照ASO 3证实PrP降低是ASO对抗病毒疾病的作用机制，表明在预防和延迟治疗范例中，ASO介导的PrP降低了延长的生存率和延迟的疾病进程。

研究了足以在接种病毒的小鼠中起到保护的最小PrP抑制水平。因此，在阮病毒病中，剂量依赖性的PrP降低转化为剂量依赖性的获益，至少21％的RNA抑制可延长生存期。由于所有病毒株都具有相同的PrP底物，因此假设通过遗传或药理学方法降低PrP会有效改变整个菌株中的pr病毒疾病。为了检验这一假设，用五种不同来源的先前先前表征的小鼠适应实验室病毒菌株对小鼠进行了攻击，PrP降低的动物在各种品系中均会延迟疾病的发生并延长生存期。

该研究进一步表征了病理学的时间过程后，评估了病理学生物标志物是否以及如何响应降低PrP的治疗。为了评估NfL对治疗的反应，表明与疾病相关的变化开始发生后，ASO介导的PrP降低可以逆转病理。这是首次在阮病毒感染的动物中证实了疾病的可翻译生物标志物的药理学逆转。

尽管使用了不同的ASO盐水处理动物中的BLI会通过疾病终末急剧上升，而活性ASO 1处理动物中的BLI则通过终末终点保持较低水平。与NfL相比，星形胶质增生在治疗后的任何时间点都不会反弹，即使这些小鼠以类似的延迟时间表发展出典型的pr病毒疾病。这些发现提供了进一步的证据，表明降低PrP可以逆转病理变化，观察到达到症状终点的时间急剧增加，这是由于健康寿命的增加以及初始症状下降的减缓而驱动的，体现在体重，症状和病理方面。

以120 dpi的处理可延长大多数动物的生存时间，使体重减轻一些恢复（图7B），并减轻症状的积累和减少。失去行为能力到132和143 dpi的时间点，分别相当于到达终端终点的时间的81％和85％，大多数或所有动物（分别为22/23和23/23存活的动物）已经从其各自的峰值体重下降。到143 dpi的时间点，缺陷也很明显。在这些时间点，ASO治疗仅对少数动物有效。 35％经ASO处理的动物在手术后即刻存活，比盐水处理的对照组存活时间长10％（约17天）。这样做的寿命更长（平均85天），尽管体重或巢建没有任何可衡量的恢复。到156 dpi时，当7/23（30％）的拟治疗小鼠已经达到疾病的终末终点时，降低PrP的治疗无效。

该研究详细的证实了降低PrP的ASO可以在预防和延迟治疗范式中延长脑内接种的病毒疾病模型的生存期，而非靶向PrP的ASO则不能。

证实先前的降低PrP的ASO可有效对抗病毒疾病发现。降低PrP的ASO可以在预防和延迟治疗范式中延长脑内接种的病毒疾病模型的生存期，而非靶向PrP的ASO则不能。这些数据提供了关于阮病毒疾病中ASO作用机理的重要说明，尤其是PrP的这一背景，在此确认RNAse H介导的而不是适体的体内作用机制非常重要。

在剂量反应研究中，观察到Prnp RNA抑制程度与生存期之间存在明显的关系PrP的药理学和遗传学降低均对测试的五种病毒菌株中的五种有效，并且未观察到耐药性的出现。对Prnp RNA敲除和功效之间的定量关系的观察增强了PrP还原的效力，这是发现和确定of病毒疾病的寡核苷酸疗法的优先顺序的关键标准。

这些数据对于确定CSF PrP浓度作为降低PrP药物的药效生物标志物也很重要。验证了ASO的体内作用机制，PrP降低程度与疾病延迟之间的紧密关系以及此处观察到的各种阮病毒株的功效。给定的降低PrP剂量的给药方案的有效性可能取决于疾病的阶段，这表明可能需要根据试验人群的临床情况来调整剂量方案和试验终点。

该研究结果为降低PrP可能是一种有希望的治疗策略提供了乐观的依据，可以用于预防高风险人群中没有发生疾病过程的病毒病发作。

原始出处：
Eric Vallabh Minikel, Hien T Zhao, Jason Le,et al.Prion protein lowering is a disease-modifying therapy across prion disease stages, strains and endpoints.Nucleic Acids Res. 2020;gkaa616. doi: 10.1093/nar/gkaa616.