73分的Nature顶级子刊重磅综述来了!卢煜明教授为你详解肿瘤标志物!

2022-08-08 康海钰 解螺旋

大多研究倾向于将主要焦点放在某一类液体活检生物标记物上,我们还需要更努力用多种液体活检生物标记物生成数据,从单个血液样本中获取更多诊断信息。

循环生物标志物与肝细胞癌

肝癌的早期筛查一直是研究的热点,而传统的血清学指标AFP虽然被广泛使用,但饱受争议,同时随着新技术的发展,肿瘤相关游离DNA的检测等新方法不断涌现。针对该领域涉及的相关争议及问题,上个月8号,由英国利物浦大学、香港中文大学和美国约翰•霍普金斯大学学者组成的国际团队在Nature子刊 Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology Genetics(1区,IF=73.082)上发表了题为“Circulating biomarkers in the diagnosis and management of hepatocellular carcinoma (循环生物标志物在肝细胞癌诊断和治疗中的应用)”的综述。

 

此文对新旧两代肝癌循环生物标记物进行了综述,主要总结对比了循环核酸生物标记物在肝癌早期筛查和诊疗中的研究,并对未来的发展方向和挑战进行预测。

文章作者Y. M. Dennis Lo:卢煜明,1963年10月12日出生于香港,分子生物学临床应用专家,英国皇家学会院士、美国国家科学院外籍院士、发展中国家科学院院士、香港科学院创院院士,现任香港中文大学医学院副院长(研究)、化学病理学系系主任、李嘉诚健康科学研究所所长,香港中文大学化学病理学讲座教授、李嘉诚医学讲座教授。卢煜明致力于研究人体内血浆的DNA和RNA,1997年就发现了孕妇外周血中存在游离的胎儿DNA,并发展出了一套新技术来准确分析和度量母亲血浆内的胎儿DNA,被誉为无创DNA产前检测的奠基人。

摘要

肝细胞癌(HCC)是世界范围内最常见、最致命的癌症相关死亡原因之一。HCC的治疗仍面临着很多问题,并且在很大程度上依赖于早期诊断。利用腹部超声对高危人群进行监测,结合或不结合血清甲胎蛋白(AFP)分析,可以发现早期、有可能治愈的肿瘤,但其敏感性有限。本文回顾了当前可解决这一限制的两种方法。

第一种是将依赖经验而生的旧生物标志物(如AFP)现在重新应用于统计模型中。第二种是使用循环核酸生物标志物,包括游离DNA(例如,循环肿瘤DNA,游离线粒体DNA和游离病毒DNA)和游离RNA,现代分子生物学技术和机器学习技术的应用与肿瘤的基础生物学特征密切相关。总而言之,这两种方法很可能是互补的,二者在实现早期诊断和提供额外功能方面(包括改进疗效监测和对疗效的预测)具有较好前景。

简介

肝细胞癌(HCC)是世界范围内癌症相关死亡的最常见原因之一(每年约80万例),也是西方国家增长最快的癌症相关死亡原因。在确诊HCC后,只有不到20%的患者能存活1年以上。这些严峻的数字说明了这一问题的严重性、该疾病的侵袭性以及现有治疗选择的有限性。目前的潜在治愈手段,包括手术切除、肝移植和局部消融,都是通过使用常规超声检查,使用或不使用肿瘤标志物甲胎蛋白(AFP)4,5的监测,来对高危患者(通常是那些慢性肝病处于肝纤维化或肝硬化晚期的患者)进行早期诊断才能做到的。

肝细胞癌监测这个概念和其实现方式备受争议,许多人认为,在没有任何明确的对照试验结果证实这种方法对于诊断更有益的情况下,不应采用监测这个手段。实际上,即使在那些支持监测的人中,在常规超声检查外再使用血清生物标记物来检测能否更有益也同样存在争议。

循环生物标志物有三个常被引证的作用:临床诊断、监测疾病进展和评估预后。例如,循环核酸生物标志物在早期检测HCC中被证明是可行并适用的。对循环肿瘤DNA的分析使得对肿瘤晚期患者实施精准治疗和对微小残留病变(MRD)的无创检测和监测成为可能9,但对全身化疗反应准确预测仍然是一个难题,迄今为止也没有什么取得成功的结果。HCC流行病学的变化对生物标志物的作用也有重要意义。肝细胞癌发病率的上升主要归因于肥胖和相关的非酒精性脂肪性肝病。超声检查对晚期结节性肝病的诊断敏感性已经很有限,在肥胖人群中灵敏度则会变得更低,而此时血清生物标志物可能会起到重要的补充作用11。

在这篇综述中,作者首先考虑了所谓的旧生物标志物的再现和再利用,这些标志物的使用在很大程度上是基于经验的;它们的再现和创新之处可能在于分析方法。作者认为液体活检是一种与肿瘤生物学更密切相关的方法,也更符合当前转化研究的概念。尽管有很多有前景的研究,但在过去的20年里,真正有临床效果的生物标志物很少,而长期存在的生物标志物,尤其是AFP,它的再现受到了更多的关注。尽管在临床实践中已经使用了60多年的AFP作用依旧存在高度争议,但所有新方法一经提出都会与之进行比较。因此,我们首先对这种蛋白质进行简要回顾,然后讨论那些可能取代它的新技术,包括检测突变、表观遗传学改变和与肿瘤基因组相关的病毒DNA。

关键点

◆ 用于肝细胞癌(HCC)治疗的有效临床生物标记物研究进展缓慢;尽管甲胎蛋白(AFP)存在很多争议和局限性,但它依旧在被广泛使用。用于肝细胞癌(HCC)治疗的有效临床生物标记物研究进展缓慢;尽管甲胎蛋白(AFP)存在很多争议和局限性,但它依旧在被广泛使用。

◆ 目前迫切需要预测系统治疗反应的生物标记物;AFP是唯一可以预测疗效的生物标记物,而它仅被用于在二线治疗中使用雷莫芦单抗的患者中。

◆ 在诊断、预测和预后方面,有前景的生物标记物组合主要是基于病例对照研究得出的;在得到前瞻性研究的支持之前,对于这些标记物仍应保守看待。

◆ 基于基因组和表观遗传学变化的游离DNA(cfDNA)可以作为早期HCC和监测微小残留病变的有效生物标记物。

◆ 循环肿瘤DNA(cDNA)的遗传变化分析可以破译肿瘤异质性,以促进晚期HCC患者的精准肿瘤学治疗。

◆ 游离线粒体DNA、游离病毒DNA、cfRNA和细胞外囊泡作为肝癌的潜在生物标记物的情况下,液体活检的优势可以超越基因组DNA分子。

AFP的生物学、功能与争议

人类的AFP由位于第4号染色体长臂(4q25)的AFP基因编码,属于类蛋白基因超家族的成员。AFP是在人胎儿血清中发现的最为丰富的血浆蛋白。在妊娠的前三个月,AFP水平下降,白蛋白(ALB)水平增加,AFP经常被认为是“胎儿白蛋白“,事实上,这两种分子的确显示出相当程度的序列同源性。通常在8至12个月时便可达到正常成人血清水平,只有在肝病患者,特别是在原发性肝脏肿瘤(包括儿童肝母细胞瘤和成人肝细胞癌)、生殖细胞肿瘤患者和良性肝脏疾病患者中,其血清AFP水平才会再次上升,不过良性肝病患者上升程度较轻。

1AFP在肝细胞癌中的临床角色

由于肝细胞癌往往发生于已经受损的肝脏(通常为纤维化或肝硬化),因此诊断试验区分的不是肝癌患者和健康人,而是肝癌患者和慢性肝病非肝癌患者。在只患有慢性肝病的患者中(即不合并HCC), AFP血清水平可轻度升高,这可能反映了肿瘤容受的组织环境,并可用于评估患者发生HCC的风险,这些观察结果对肝癌检测的敏感性有影响。

然而,多篇综述和META分析已经清晰呈现了基本数据,受试者工作特征曲线下的面积(AUROC)在0.80 -0.85之间,这个结果支持了GALAD评分的诊断准确性(得到2篇综合敏感性约为0.6的META分析支持).。Marrero等人在早期、可能治愈的 (巴塞罗那临床肝癌(BCLC) 0期和A期,n = 208)患者中,发现了类似的结果。在常规超声检查中加入AFP检查可提高早期HCC检测灵敏度的证据较弱,但2018年进行的一项META分析显示加入AFP检查更有益处,因此许多国际指南现在建议的监测指标是超声检查“加上或不加上”AFP。有证据表明,在临床诊断为HCC的数年前,患者AFP水平就已升高,这进一步支持了上面的观点。

2AFP作为药物反应的预测因子

晚期HCC的全身治疗或用索拉菲尼治疗(作为标准治疗已有10年)疗效微弱的原因一直备受猜测。可能的原因之一是缺乏有效的生物标志物和/或富集策略,因而无法确定会有哪些患者受益。经过十年的深入研究,没有找到可以预测索拉菲尼或任何其他药物反应的生物标志物,而唯一的例外是AFP。

一项在565例肝癌患者中进行的随机对照试验显示,索拉非尼治疗失败后,雷莫芦单抗并没有带来总体获益,但一项事后分析表明,高AFP水平亚组生存率会更高,一项在292例HCC和AFP水平为>400 ng/ml的患者中进行的前瞻性试验表明:接受雷莫芦单抗的患者确实比接受安慰剂的患者生存时间长1.2个月。

3AFP与肝移植

美国移植受体科学登记处回顾性分析了6817例被诊断为HCC的患者,结果显示:AFP水平从>400 ng/ml降至≤400 ng/ml的患者,比局部治疗后AFP水平无法降低的患者有更好的意向治疗生存率。苏黎世共识指出:AFP在HCC患者中具有额外的预后价值,并且该标志物结合影像学标准可能有助于确定肝移植的适应症。Duvoux等人证明,与单用米兰标准相比,AFP水平与米兰标准中常见的肿瘤大小和数量标准结合使用显著提高了对肝癌复发的预测(P < 0.001)。2021年,有国际研究团队提出将AFP反应(AFP- R)纳入米兰选择标准或其他肝移植选择模型。AFP-R测量的是肝移植前AFP最高水平和最终水平的差异。将AFP-R纳入监测似乎可以安全地补充目前使用的形态学肝癌选择模型。

4组合方法

在围绕血清学诊断和监测方法的争议中,AFP遭到了非常强烈的抨击,包括“一则讣告”、“该退出了”、“明星的消亡”以及“为何APF不能安然走入良夜”。为什么AFP会引发如此强烈的争议?也许是因为AFP在成人中的功能仍然是未知的。由于AFP是偶然发现的,关于它为何与HCC相关还没有达成共识,这使得它在当前理性的转化医学研究环境中成为一个并不受欢迎的标记。因此,以AFP作为监测和诊断的基础和/或主干,另外再添加一些额外的标志物(被称作组合方法)来提高敏感性和特异性似乎是一个基于证据的方法。

1.  GALAD评分

经过几十年的研究,日本研究人员将AFP与另外两种标志物,脱-γ-羧基凝血酶原(DCP)和AFP-L3 (AFP的一种亚型)相结合,来诊断和监测HCC。DCP(也被称为维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导的蛋白质PIVKA-II)是一种未成熟的凝血酶原。血清DCP水平升高(≥7.5 ng/ml)时发生HCC的风险会增加5倍,在此基础上,DCP已获得FDA批准进行风险评估。AFP-L3是一种糖蛋白,通常由胎儿肝脏产生,是可以根据凝集素结合特性分离的三种AFP糖型之一,最容易与小扁豆凝集素(LCA)结合。在成人中,AFP-L3水平的升高似乎比AFP总水平的升高更具特异性。AFP-L3水平通常以占总AFP的百分比作为指标,参考范围为<10%。

一种称为GALAD(性别、年龄、AFP-L3、AFP、DCP)的统计模型正式将三种血清生物标志物与年龄和性别结合起来,产生了一种比用单一指标性能更好的算法(GALAD的AUROC为0.9662,而AFP-L3、AFP和DCP的AUROC分别为0.8430、0.8775和0.9030)。

GALAD模型的形式为:Z =−10.08+0.09×年龄(年)+1.67×性别+2.34×log[AFP (ng/ml)]+0.04×AFP-L3 (ng/ml)+1.33×log[DCP (ng/ml)],其中“性别”为男性时值为1,女性时值为0。该模型的AUROC>0.9,即使对于较小肿瘤也能很好地预测出来。在由罗切斯特市的梅奥医学中心(Mayo Clinic)组织的一项北美多中心研究(291名参与者)中,该模型的性能(图1)得到了独立验证(表1)。此研究尤为重要,因为它提示该模型在监测能力上可能比超声检查更佳。此外,在慢性丙型肝炎患者中,该模型不受HCC病因的影响,也不受是否存在持续病毒学应答的影响。

图1

表1

基于这些发现,FDA于2020年授予GALAD评分“突破地位”。然而,尽管有这些令人鼓舞的结果,但报告的性能指标都是基于病例对照研究,由于病例对照研究可能会高估生物标志物的性能,这也许并不是测试潜在生物标志物的最佳方式。因此,在得到大型前瞻性研究证实之前应对其采取保守的判断。第一项大型前瞻性研究已经得到了很有希望的结果49,而更大规模的前瞻性试验目前正在亚洲和中东进行。

2.  BALAD评分

由Toyoda等人提出的BALAD评分结合了5个临床变量(胆红素、ALB、AFP-L3%、AFP、DCP)来辅助评估HCC51患者的预后。当使用严格的统计方法对相同的数据集进行重新评估和外部验证时,该模型(现在称为BALAD-2)的性能是相似的,这显示了临床直觉和经验的力量。该模型将HCC患者风险分层为4个等级以准确判断预后,并合理地确定了HCC预后的两个因素,即肝功能和肿瘤相关事实。”BALAD”中的“BA”与肝功能有关,“LAD”与肿瘤特征有关。该模型对所有病因和HCC治疗方式(包括手术切除、局部消融治疗(即射频消融和经皮乙醇注射)和经动脉化疗栓塞)的鉴别能力是显著的。

3.  Doylestown算法/ Doylestown +

Doylestown算法(DA)包括log(AFP)、年龄、性别、血清碱性磷酸酶水平和谷丙转氨酶水平。Wang等人通过360例肝硬化患者的内部验证队列和2700例肝硬化患者的外部验证队列得出:与单用AFP相比,DA能显著提高肝癌的检出率(P<0.0001)。虽然该方法对于AFP <20 ng/ml的患者来说准确率不高,但通过纳入岩藻糖基化激肽原fucosylated kininogen(即Doylestown Plus)可以使其更准确。在一项有69例早期HCC患者和93例肝硬化但无HCC患者作为对照的研究中,Doylestown Plus的AUROC高于单独的DA或AFP。

4.  HES算法

HES(肝细胞癌早期检测筛查)算法结合了年龄、AFP、1年内常规临床随访期间AFP变化率、血清谷丙转氨酶水平和血小板计数,并进行了内部和外部验证,但验证仅在美国退伍军人事务部的一组活动性丙型肝炎病毒和肝硬化患者中进行(n=38431)。HES算法在诊断HCC前6个月内识别出HCC患者(n=4804)的特异度为90%,敏感度为52.56%,而单独用AFP的敏感性为48.13%。

磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(Glypican-3)

Glypican-3(GPC3)是一种通过糖基磷脂酰肌醇锚蛋白附着在细胞表面的蛋白聚糖,它在大多数HCC中表达,但在正常肝脏或肝硬化肝脏中不表达。GPC3的免疫染色在HCC的诊断病理学中得到广泛应用。GPC3可能为肝癌的治疗提供了新的靶点,而相关的临床试验也正在进行中。GPC-3已被提议作为肝癌的血清学标志物,一项META分析(2019年进行)显示其合并灵敏度为55%,特异性为58%(AUROC为 0.7793)。这种相对较高的特异性使其可以作为AFP或其他HCC生物标记物的补充生物标记物,在单独或联合使用的情况下提高它们的敏感度。

液体活检

除了上述标记物外,循环核酸标记物,如游离DNA(cfDNA),正在液体活检的概念中逐渐成为了肝癌的生物标记物。cfDNA是通过凋亡、坏死和活性分泌从细胞释放到体液(包括血液、尿液和脑脊液)中的DNA分子。虽然在1948年就首次报道了血浆中cfDNA的存在,但直到1989年,癌症患者血浆的DNA片段才被认为来源于癌细胞,这也在1994年的急性髓系白血病和胰腺癌研究中得到证实。

从这时起,肿瘤细胞释放的cfDNA的一个子集,循环肿瘤DNA(ctDNA)开始吸引了大量关注。目前,基于ctDNA的液体活检正广泛应用于癌症诊断、治疗指导和患者护理。cfDNA分子的亚群,例如游离线粒体DNA(mtDNA)和游离病毒DNA、cfRNA和细胞外囊泡(EVs),都是肿瘤学中的生物信息标记物(图2)。

图2

 

1用于早期检测肝癌的ctDNA

1) 基因组变化

液体活检在包括肝癌在内的多种癌症类型中显示出有前景的结果,因此我们有必要进一步探索其在高危人群监测的潜力(图2;表2)。

表2

多项研究证实了检测HCC患者血浆DNA中特异性突变的可行性。然而,由于癌症早期的ctDNA含量较低,因此准确区分PCR和测序错误中的真实突变是一项具有挑战性的任务。为克服这个问题已开发了多种技术,包括微滴式数字PCR、基于磁珠和微乳液的固相数字 PCR 技术BEAMing和几种下一代测序策略。

另一个例子是应用基于唯一分子标识符(UMI)的方法,将UMI整合到每个DNA分子中,从而能够将PCR重复序列追溯回原始DNA模板。在2021年,一种称为SaferSeqS(安全测序系统)的方法将UMIs与链特异性扩增相结合,获得双链的突变以进一步校正,据报道最低检测限度为0.001%,随之而来的问题是:在早期癌症检测方面,究竟多高的检测灵敏度才足够。从10毫升全血中可以获得大约4毫升血浆,通常可从中提取大约40 ng DNA 。一个基因组当量相当于约6.6 pg DNA。

因此,4毫升血浆可包含约6000个基因组当量(即每个基因约12000个分子)。如果这12000个分子中存在一个突变,突变等位基因频率将约为0.008%(1:12000)。换句话说,检测4毫升血浆中突变的理论检测下限必须低于0.008%。然而,如果血浆中出现的突变等位基因频率本来就低于0.008%,那么从4 毫升血浆中检测单个突变在统计学上并不可靠。

克服上述问题的一种方法是利用一组已知在HCC肿瘤中经常出现的靶突变(基因包panel)。基于靶基因包的液体活检分析方法也适用于HCC筛查。例如一个中国研究小组进行的HCC筛查研究结合了血浆DNA遗传改变和两种血清蛋白标志物(AFP和DCP)来早期检测HCC,这样的一组遗传区域包括TP53、CTNNB1和AXIN1编码区、TERT启动子区和乙肝病毒(HBV)整合区。利用这种方法,研究人员在高危患者(乙肝表面抗原阳性,但筛查阴性,即肝脏超声和血清AFP水平均正常)中检出早期HCC,表明液体活检优于常规筛查程序。

液体活检的另一个优点是,它可以通过一次抽血进行泛癌诊断。在一项1005名确诊癌症患者的病例对照研究中,一组血液标志物(即CancerSEEK)包括循环蛋白和突变(即包含了16个热点突变的61个扩增子包,如TP53、CTNNB1、PIK3CA和PTEN),在包括HCC在内的各类癌症诊断方面取得了较好的结果。该研究的局限性是所有病例均为有症状的患者,未来还需要在无症状人群中进行研究。

为了突破这一局限,这组研究人员对近10,000名无癌症病史的人群应用了改进的CancerSEEK方法(称为DETECT-A血液测试),并进行了PET-CT验证了结果,最终有26个病人通过这种液体活检被正确检出。然而,由于症状表现或其他原因,另有70名癌症患者是通过标准治疗筛查被确诊的,这表明还需更多研究来确定这项新技术在现有筛查流程中的地位。

值得注意的是,基于突变的液体活检标记物有几个潜在的局限性。例如,一项研究表明,cfDNA的很大一部分突变(健康个体中有81.6%,转移性癌症患者中有53.2%,包括乳腺癌、非小细胞肺癌和前列腺癌)来自克隆性造血。因此,克隆性造血相关突变的存在会混淆对肿瘤相关突变的检测,导致当合适的对照DNA(例如,配对白细胞的DNA)不可用时出现假阳性。除了克隆性造血的混淆效应,癌前病变组织中存在的突变将进一步对HCC的检测造成阻碍。在一项研究中,肝硬化患者中约6%和20%的低级别和高级别异常增生结节存在与TERT基因启动子相关的HCC热点突变,在10-15%的肝腺瘤中发现了与CTNNB1相关的突变。

2) DNA甲基化

鉴于基因组监测的局限性(表2),血浆表观遗传变化在早期癌症检测中的潜力已得到越来越多的研究。血浆中研究最充分的表观遗传信号是CpG位点的甲基化(即,5-甲基胞嘧啶) 。人类基因组中大约有2800万个CpG位点,为生物标志物的探索提供了宝贵的资源。此外,DNA甲基化的变化发生在肿瘤形成的早期,这使得其在早期检测方面具有诱人的前景80。

因此,CpG位点的甲基化为癌症检测提供了丰富的信息来源,突破了与基因组检测相关的几个限制。例如,甲基化变化具有组织特异性,因此液体活检这些生物标记物可以指向癌症的可能位置。这种组织特异性也可能使基于甲基化的液体活检由于克隆性造血而出现的假阳性结果更少。

全基因组亚硫酸氢盐测序法表明了利用液体活检进行全基因组表观遗传学检测癌症的可行性。在过去的几年里,人们已经开发出了更具针对性和高性价比的方法,如甲基化CpG短串联扩增、游离甲基化DNA免疫沉淀测序和靶向亚硫酸氢盐测序,特异性地富集来自CpG位点的DNA分子。一系列的研究证实了这种表观遗传学方法在HCC的早期检测中的普适性。

例如,一项研究使用了401个在HCC患者组织和全血有差异的甲基化CpG位点,对其血浆DNA进行亚硫酸氢盐靶向测序。作者仅使用10个有价值的CpG位点构建了一个区分健康个体(训练集n=560;验证集n=275)和肝癌患者(训练集n=715;验证集n=383)的诊断预测模型,其敏感性为83.3%,特异性为90.5% 。此外,该模型与肿瘤负荷和分期高度相关,尤其是在AFP值无统计学差异的早期HCC患者中,这表明该模型在早期发现肝癌方面比AFP更具优势。

2019年,根据上述研究实施的IvyGene肝试验(IvyGene liver test)显示,其对HCC的诊断能力有所提高(灵敏度95%,特异性97.5%),FDA为其颁发了突破性医疗器械认定。通过ctDNA甲基化模式的泛癌早期检测也取得了一些进展。2020年,一个研究小组报告称,cfDNA的靶向甲基化分析使不同阶段的多种癌症的同时检测和组织来源鉴定成为可能,该研究对50多种癌症的来源组织进行了检测,准确率约为93%。

3)5-羟甲基胞嘧啶

随着对肿瘤发生和进展中DNA去甲基化的认识增加,监测TET酶介导的DNA去甲基化(例如,5-羟甲基胞嘧啶(5hmC))是液体活检的一个新兴领域。两组通过选择性化学标记方法确认了5hmC在血浆中的可检测性,其中5hmC用生物素标记并用链霉亲和素磁珠富集,然后测序以确定5hmC的基因组分布。血浆DNA 5hmC测定技术正朝着早期癌症检测方向发展。2019年,一个研究小组分析了2554名有或没有HCC的中国人的全基因组5hmC分布,通过应用32个基因的诊断模型,研究人员准确地将早期HCC(BCLC 0和A)患者(AUROC 0.884)与非HCC患者(包括慢性HBV感染或肝硬化患者以及健康个体)区分开来。

2微小残留病变中的ctDNA

肝癌切除术后复发率约为50%-70%。因此,预测MRD(即治疗期间或之后,或缓解期患者体内残留的癌细胞)的存在和复发对于早期HCC患者的临床决策具有重要价值(图2),该原理类似于上述早期癌症检测。不同之处在于对切除的肿瘤进行分析阐明组织中存在的改变,从而使得在MRD期间血浆监测具有特异性靶向性。液体活检在肝癌的MRD和复发监测中的效用已经在基因组和表观遗传学水平上得到了测试,目前的结果表明,在患者的样本中检测到ctDNA是MRD和复发的风险因素。此外,一项研究表明,全面的ctDNA分析可以在MRI前预测复发,并且在HCC中的表现似乎优于血清生物标记物AFP、AFP-L3%和DCP。

3肝癌精准肿瘤学中的ctDNA

目前,尽管在早期检测肝细胞癌方面进行了大量研究,但仍有超过50%的肝癌患者在诊断时已处于晚期。由于化疗药物的获益有限,对于晚期肝癌推荐的一线治疗是靶向治疗。肝癌精准肿瘤学面临的一个问题是缺乏有效的用于正确选择患者和早期识别获得性耐药的生物标记物(图2)。越来越多的证据表明,液体活检由于其非侵入性和能够总览癌症异质性,大大补充了精准肿瘤学中的组织活检样本。人们在测试基于突变的液体活检在精准肿瘤学中的效用方面已经做出了许多努力。

例如,在TARGET研究(肿瘤特征化以指导实验性靶向治疗)中,有一项旨在测试液体活检在多种的晚期癌症(但不包括肝癌)患者-治疗匹配中的效用的分子分析计划,研究人员在100名患者中的41名患者中发现了可操作针对的改变(等位基因变体分数>2.5%),其中11人接受了相应的分子治疗,并显示出疗效。至于肝细胞癌,在一项有关瑞法美替尼和索拉非尼的II期研究中, ctDNA被用来确定1318名参与者中合适的患者(即RAS突变患者)。在另一项研究中,两名具有可供药物治疗的ctDNA改变的肝癌患者接受了相应的的靶向治疗,两人均对该疗法有反应。目前关于肝癌一线药物患者选择的研究较少,尚需进一步探索。

作为一种非侵入性方法,液体活检是治疗期间持续监测获得性耐药的有力工具。在非小细胞肺癌患者和接受抗EGFR治疗的结直肠癌患者中,液体活检用来检测EGFR、KRAS和NRAS突变,这些突变可能导致对治疗的耐药性。然而,肝癌患者服用的药物通常是多激酶抑制剂。与抗EGFR治疗不同,一个或两个基因改变不会直接导致对这些治疗的耐药性,这会限制监测特定突变在预测耐药性中的应用。在这种情况下, ctDNA定量检测以预测肿瘤负荷可能是一种替代方法(图2)。事实上,血浆中HCC特异性突变的频率与HCC肿瘤负荷有良好的相关性,并且在预测耐药性和患者生存率的应用中结果尚佳。

4肝癌液体活检中的其他液体活检标记物

液体活检不仅仅局限于ctDNA的遗传和表观遗传变化,甚至可从循环DNA分子的碎片获取信息,称为片段组学特征。cfDNA因其与核小体结构有关,长度多为170bp,与其不同的是,ctDNA在较短(<150 bp)长度的群体中更容易检测到。此外,ctDNA显示出不同的片段标记,例如,5′端基序、首选端和核小体印迹。值得注意的是,有研究通过将5hmC谱与cfDNA片段谱相结合,将早期HCC患者(n=201)与肝硬化患者(n=2247;BCLC A的AUROC为0.944,BCLC 0的AUROC为0.889)区分开来,优于AFP和/或DCP和个体特征。先前有文献详细回顾了片段组学特征在癌症中的生物学和潜在的诊断应用。此外,游离病毒DNA、游离线粒体DNA、cfRNA和EV在肝癌治疗中也都具有很大的潜力。

1) 游离病毒DNA

全球约50%患者的HCC是由慢性HBV感染发展而来。80-90%的HBV相关HCC患者发生了HBV DNA的随机整合,每个细胞的整合位点都产生了独特的连接片段。因此,肝癌细胞在肿瘤转移过程中释放的嵌合DNA片段被认为是HBV相关肝癌的ctDNA(图2),而血浆嵌合DNA主要来源于肿瘤组织,而不是邻近的非肿瘤性肝组织。因此,血浆HBV整合DNA的丰度可用于促进肝癌的诊断。此外,研究表明,血浆嵌合DNA的存在是早期复发的独立风险因素,根据整合位点的甲基化水平可以准确区分HCC和非HCC样本。

血浆病毒DNA检测的潜力在鼻咽癌早期筛查中得到验证。来自Epstein-Barr病毒的血浆DNA被成功应用于从20174名参与者中筛查鼻咽癌,其敏感性和特异性分别为97.1%和98.6%。由于观察到高病毒载量与HCC发展相关,肿瘤源性HBV DNA可能可以给早期HCC筛查提供丰富信息,同时它还克服了低肿瘤负荷的限制。

2)游离线粒体DNA

在关于不同癌症的多项研究中,游离线粒体DNA的存在均已被证实。与二倍体核DNA不同,线粒体DNA的拷贝数可以从100拷贝到10000拷贝以上,这取决于细胞类型和病理条件。在人类肝癌细胞中,线粒体DNA的拷贝数似乎明显减少。此外,由于缺乏保护性组蛋白和效率低下的DNA修复系统,线粒体DNA的突变频率高于核DNA。HCC表现出大量线粒体DNA突变,组织中线粒体DNA突变的积累反映了肿瘤分化的程度。到目前为止,对于HCC患者血浆线粒体DNA水平的改变以及血浆中HCC特异性线粒体DNA突变的可检测性尚无共识。尚需更多研究来验证游离线粒体DNA水平和突变对肝癌诊断和预后的临床效用。

该领域另一个未来方向是游离线粒体DNA的拓扑结构。据报道,血浆中同时存在线性和环状线粒体DNA,而在接受肝移植的患者中肝源性线粒体DNA主要呈线性。线性线粒体DNA比例与血浆DNA中的肝脏DNA比例密切相关,因此它是监测移植后肝功能的潜在生物标记物。

3)cfRNA和细胞外囊泡

生物标记物的另一个信息来源是cfRNA,这是一个大家族,包括microRNA(miRNA)、mRNA和长链非编码RNA(lncRNA)。血浆中肿瘤衍生cf-mRNA 的存在已被证实,其被用于癌症检测、肿瘤组织起源预测和癌症亚型测定。除cf-mRNA外,cf-lncRNA和cf-miRNA也是肝癌治疗的替代生物标记物,其在肝癌诊断和生存预测中的应用已得到评估。

cfRNA可能与EV相关,因此可以不被降解(图2)。EV是一组由细胞自然释放的脂质双层颗粒,包括凋亡小体、微泡和外泌体。miRNA在EV中特别丰富。肿瘤源的外泌体miRNA分析可以反映肿瘤相关信息,其在肝癌复发和生存预测中的效用已经过测试。由于EV也可以携带蛋白质,因此对货物蛋白的分析可能有助于获得EV分类的有效标记和EV亚家族的详细特征以用于诊断。

例如,基于芯片的新型富集平台可以促进基于货物蛋白的EVs的高通量和高纯度分离。有研究使用一种新的基于HCC EV芯片的纯化系统,在通过靶向三种HCC相关表面蛋白标记物(即上皮细胞粘附分子(EpCAM)、去唾液酸糖蛋白受体1(ASGPR1)和CD147)富集HCC相关EVs后,HCC EV源性mRNA标记物(例如AFP、GPC3和ALB)在早期癌症非侵袭性筛查中显示出巨大潜力(敏感性94.4%,特异性88.5%)。

结论

在过去的20年中,具有实际临床效果的肝癌生物标志物不断涌现。甲胎蛋白作为一种生物标志物在临床应用已有60多年的历史;然而,它的作用仍然备受争议。这种争议主要是由于AFP和HCC之间关系背后的生物学不明确,这使得AFP在当前理性的转化研究环境中变得不具吸引力。

在过去的几十年中,将AFP与其他一些标记物相结合的组合方法(例如,GALAD评分、BALAD评分、Doylestown算法/Doylestown Plus和HES算法)在肝癌监测和诊断方面取得了很好的结果,尽管上述组合方法很有前景,但仍应谨慎使用,可能有许多潜在变量(如不同的蛋白标记物和临床特征),可以使用许多不同的分析和统计方法对其进行组合。这种差异可能使我们最终得到多个性能特征几乎相同的模型,而每个模型都与不同的地域、病因和不疾病阶段相关。在临床实践中应该选择哪一个模型,以及模型对比的可靠性如何,将会成为未来十年许多研究的主题。

ctDNA、cfRNA、EV和其他cfDNA分子亚群的基因组和表观遗传学变化都是潜在的肝癌生物标志物(图2;表2)。人们试图揭示循环中核酸的来源和清除过程以了解它们如何进入和退出循环。这些可能可以解答几个重要问题,例如某些标记物是否在特定受试者中更具临床实用性,以及这种个体间差异的生物学基础是什么。另一个问题涉及液体活检生物标记物与其他模态(例如,影像学和蛋白质生物标记物)的潜在协同作用,这种模态的结合可能会提高模型最终测试的敏感性和特异性。

现在的问题是,大多研究倾向于将主要焦点放在某一类液体活检生物标记物上,我们还需要更努力用多种液体活检生物标记物生成数据,从单个血液样本中获取更多诊断信息。到目前为止,仍然没有经FDA批准的肝细胞癌液体活检分析技术,这主要是由于这类技术的分析结果缺少对患者生存的益处,希望在未来几年内有研究能够提供这些信息,最终使肝癌患者能得到较好的治疗和临床结局。

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