PCR实验室消毒用品及消毒机制

2022-08-04 检验病理新前沿 网络

不同的实验区域应当有其各自的清洁消毒用具以防止交叉污染。

作者:王晓燕 宗德琪 崔春丽

单位:同济大学附属东方医院胶州医院

众所周知,PCR实验室各区独立,压力递减,无论在空间上还是在使用中,都不能有空气的直接相通。《临床基因扩增实验室工作规范》中,有具体的清洁消毒要求,而且不同的实验区域应当有其各自的清洁消毒用具以防止交叉污染。

今天,我们就来盘点一下PCR实验室的消毒用品,阐明消毒机制,明确消毒办法。

加热

热力消毒灭菌利用热力使微生物的蛋白质凝固和变性,细胞膜发生改变,酶失去活性,以达到消毒灭菌的目的。

高温对细菌有明显的致死作用。热力灭菌法包括干热灭菌与湿热灭菌法,干热灭菌可使菌体蛋白质变性及电解质浓缩,湿热灭菌可使菌体蛋白质变性,核酸降解及损伤细菌的细胞膜,湿热灭菌有穿透力强,菌体吸收水分易变性凝固及蒸汽有潜在热能的优越性。

1高压蒸汽灭菌器

2

恒温水箱灭菌

酒精

酒精,化学名称乙醇,无色透明液体,常规使用浓度下的酒精消毒产品易燃,在室温下易挥发,挥发完全后无残余物,便于日常消毒使用。根据《新型冠状病毒肺炎防控方案》,75%酒精可有效灭活新型冠状病毒〔2〕。乙醇-水混合物的表面张力低,有湿润能力、渗透力,能进入皮肤缝隙和非生命体,它对细菌和病毒的作用机制相同,根据“相似相溶”的原理,破坏掉由磷脂双分⼦层构成的脂质包膜;同时,在接触到病毒包膜表⾯的糖蛋⽩时,使细胞病毒表面和内部脱水,含有的氢键干扰蛋白质结构,促使蛋白质变性,从而达到消毒灭菌的作用。具体过程为:乙醇分子结构有两个尾端,一端是憎水性的(一C2H5),能够毁坏蛋白內部憎水性官能团中间的诱惑力;一端是亲水性的(一OH),但它无法毁坏蛋白外界的亲水基团中间的诱惑力。于是蛋白质分子长链伸展、松驰,在其中关键是毁坏产生蜷起和螺旋式的各种各样力最终使使蛋白质水解。水分尽管能够松驰蛋白亲水基团中间的诱惑力,但它即便钻入病菌內部,也没法毁坏其蛋白中憎水性官能团中间的诱惑力。因此,纯酒精或水也不能使病菌内的蛋白质水解,仅有酒精和水相互存有,另外使维持蛋白几何图形样子的各种各样诱惑力松驰,蛋白才会丧失生理学特异性。因而,仅有一定浓度值的酒精溶液,才可以做到优良的杀菌消毒目地。

国外学者曾经通过在德国公共管理机构等开放区域,对使用酒精类手部消毒剂的影响开展调查,用以评估在开放社区工作场所中进行酒精手部消毒的有效性,结果表明手部消毒对急性呼吸道和胃肠道感染具有预防作用,对普通感冒、咳嗽、发热和腹泻的预防作用最大[1]。一组对儿童开展前瞻性队列研究,探讨使用含酒精的手消毒液对儿童呼吸道和肠胃道疾病的影响,结果表明使用含酒精类消毒剂可有效减少儿童在护理过程中患呼吸道传染病的风险[2]。

含氯消毒剂

含氯消毒剂具有较强的杀菌、杀病毒和去污作用,属于高效消毒剂,又因其物美价廉而被广泛应用于医院和环境消毒。含氯消毒剂易分解、不稳定、有效氯含量不断下降是其应用过程中最大的局限性[3],所以要现配现用,一般不超过24小时。《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册(试行  第二版)》提出,0.2%含氯消毒剂用于PCR实验室日常消毒,0.55%含氯消毒剂用于标本污染和感染性废液的处理。

氯对细菌损伤的模型示意

氯对病毒损伤的模型示意

氯对细菌作用机制:

1.  氯消毒过程发生不可逆的细胞膜的损伤是细胞致死的主要原因。

HOCl 分子能迅速与构成细胞壁的肽聚糖上氨基酸分子和细胞质膜的磷脂质发生氧化反应,因此 SEM 观察 2 mg/L 低剂量的有效氯能导致细胞表面出现粗糙、褶皱和空洞现象,细胞形态膨胀变宽出现松散状态。

2.  氯消毒过程中新陈代谢功能的丧失。

≤5mg/L低剂量的有效氯导致细胞膜的通透性增强后,使胞内ATP被释放到

胞外,当有效氯浓度达到5 mg/L时,此时E.coli失去可培养能力,相应细菌胞内ATP含量微乎其微,致使细胞的新陈代谢功能紊乱,影响呼吸作用和细菌的运动。

3.  氯消毒过程细菌mRNA的损伤与细菌的灭活相辅相成。

HOCl分子能穿过细胞膜抵达到内部结构,从而直接影响mRNA的表达,能通过限制染色体复制启动、DNA 蛋白交联功能、干扰 SOS 应答修复系统、影响相关酶的合成多种机制下,促进 E. coli 的失活。氯消毒对 mRNA 的损伤严重程度依

次为:dnaA ≥ RecA > ssb ≥ gadA。

4.  DNA 不是氯消毒过程中的关键位点。

氯消毒对DNA的损伤较轻微,即使在高的有效氯浓度下,DNA的损伤仍然不明显。绝对定量 PCR 检测的 DNA 损失受片段长度影响,长片段的 DNA 损失略高于短片段 DNA 损失。细菌浓度越高所需越高的有效氯引起较高的 DNA 损伤。

5.  过量的有效氯能导致胞外 ATP 的水解。

低剂量有效氯导致胞内 ATP 释放后,进一步加大有效氯浓度(> 5 mg/L),能

促使胞外 ATP 的水解的发生,然而该阶段明显滞后于微生物的失活。

氯对病毒作用机制:

氯消毒的敏感靶位包括 RNA 和衣壳蛋白,氯首先接触到具有二十面体结构的衣壳蛋白,导致衣壳蛋白骨架的断裂,影响病毒基因向宿主细胞内注入的能力,病毒外围衣壳的完整性被破坏感染性消失,丢失保护核酸的能力,进一步氧化核酸形成 5-氯胞啶、8-氯鸟嘌呤及较少量的 8-氯腺嘌呤,使病毒丢失复制功能,同时能 5’非编码区的损伤导致阻断遗传物质的复制启动过程,而结构蛋白基因的损伤能终止宿主内子代的衣壳蛋白的装配过程。高浓度时蛋白交联的特定位点发生氧化反应,使病毒的蛋白交联作用受损,病毒丢失了宿主交联功能。核酸的损伤与感染性的消失不存在直接的相关关系,感染性的损伤速率明显高于核酸的损伤速率,RNA 的损伤需要更高的氯剂量。

紫外线

紫外线是波长从10~400nm的电磁波谱的总称,属于不可见光线。260nm左右的紫外线,其波长正好在DNA和蛋白质等生物大分子的吸收峰附近,容易导致这些生物大分子发生损伤。

紫外线对细菌损伤的模型示意

紫外线对病毒损伤的模型示意

紫外线对细菌作用机制:

1.  紫外线对细菌 mRNA 的损伤:紫外线消毒过程中,能导致染色体复制启动蛋白(dnaA mRNA)和单链DNA交联蛋白(ssb mRNA)功能的逐步降低,遗传复制过程整个链条受到限制,扰乱了细菌 DNA 繁殖复制功能,促使了细胞的失活,丢失可培养性。同时介导 DNA损伤修复的功能的基因受到严重损伤,Rec A mRNA 在 50 mJ/cm2时达到检测限,编码谷氨酸脱羧酶的gadA基因的表达受到轻微的影响。紫外线消毒对 mRNA 的损伤严重程度依次为:RecA > ssb ≥ dnaA > gadA。

2.  紫外线对细菌灭活的靶位点位于 DNA 上:紫外线消毒能使 DNA 发生光化学反应,引起 DNA 双螺旋结构的氢键的断裂和磷酸二酯键的断裂,产生 DNA 碎片;或者 DNA 的碱基成份胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)发生聚合反应形成环丁烷嘧啶二聚体(CPD)和 6-4 光产物(6-4PPs)。

3.  紫外线引起细菌外围结构极少量的损伤:低浓度时紫外光线能穿透细胞外围结构,直达内部核酸部位,导致细菌丢失了可培养性,而随着紫外光的累积增大到大于100 mJ/cm2时,出现不可逆的细胞外围结构的损伤,细菌表面逐步发生褶皱、凹陷和孔洞现象,在400 mJ/cm2时近似 10%的细胞发生细胞膜通透性改变,细胞的运动功能受到严重损害。尽管该细胞外围结构损伤发生的概率较低,但具有无法修复特点。

4.  紫外线对细菌 ATP 的耗损:大于 100 mJ/cm2的高紫外光照射下,促使了 E. coli 细胞膜的破损,进而随后引起与细胞新陈代谢息息相关的 ATP 的耗损,使细胞无法维持正常的生理功能,细胞呼吸、代谢功能必然受损。

紫外线对病毒作用机制:

紫外线对病毒的损伤敏感靶位点在核酸部位,即 RNA 吸收紫外光转化成尿嘧啶环丁烷二聚体、尿嘧啶水合物、胞嘧啶水合物等光化学产物,或形成 RNA-RNA 或 RNA-蛋白交联产物,从而导致病毒在宿主内的自我复制能力的消失,也限制了 RT-qPCR 的体外扩增过程,5’非编码区的损伤程度高于衣壳蛋白的基因组的损伤,阻断病毒颗粒在宿主内的子代核酸和蛋白的复制,损伤病毒的增殖能力。紫外消毒也能抑制基因组向宿主细胞的注入,表现为衣壳蛋白骨架的断裂,从而减少了基因向宿主内注入所必须的能量,但该损伤仅占小部分。而对病毒衣壳蛋白与宿主细胞的交联功能损伤作用极少。

HEPA过滤器

HEPA过滤器是生物安全柜的核心部分,由任意地被安排的纤维席子组成。HEPA过滤器是可处理的干型高效空气过滤器[4],是由叠片状硼硅微纤维制成的,影响作用的关键度规是纤维密度和直径和过滤器厚度。

B2型生物安全柜及高效空气过滤器示意图

空域在HEPA过滤器纤维之间是大於0.3 μm。共同的假定HEPA过滤器行动像a筛子那里微粒小於最大的开头可能通过是不正确的。至於为膜滤器微粒很大他们是一样宽的像纤维之间的最大的开头或距离不可能在他们之间通过。HEPA过滤器空气过滤机制有三方面:

①惯性撞击截留作用:当含有微生物颗粒的空气通过滤层时,空气流仅能从纤维间的间隙通过,由于纤维纵横交错,层层叠叠,迫使空气流不断改变运动方向和速度。由于微生物颗粒的惯性大于空气,因而当空气流遇阻而绕道前进时,微生物颗粒未能及时改变它的运动方向,而撞击并被截留于纤维的表面。

②拦截截留作用:当空气通过过滤层的气速较低时,惯性撞击截留作用作用很小,拦截截留作用起主要作用。当微粒直径小、质量轻,它随气流运动慢慢靠近纤维时,微粒所在主导气流流线受纤维所阻改变流动方向,绕过纤维前进,并在纤维的周围形成一层边界滞留区,滞留区的气流流速更慢,进到滞留区的微粒慢慢靠近和接触纤维而被黏附截留。拦截截留的截留效率与气流的雷诺准数和微粒同纤维的直径比有关。

③布朗扩散截留作用:当空气通过过滤层时,直径很小的微粒在缓慢流动的气流中,会有明显的布朗运动,促使微粒和纤维接触和被捕集。这种作用在较大的气速、较大的纤维间隙中不起作用,因为此时布朗运动不明显。

HEPA过滤器在生物医学领域,主要用于滤除空气中的细菌和病毒等有机体。一般,医疗使用HEPA滤清系统也合并使用高能紫外光模块,杀灭过滤介质中的病毒和活细菌。某些HEPA过滤器额定的HEPA单位有效率规定值99.995%,用于控制通过空气中的细菌、病毒或其它有害颗粒物传播的疾病。

  其他消毒用品及消毒办法  

其他消毒用品有乙醚、过氧乙酸和氯仿等脂溶剂。

乙醚具有一定的麻醉作用。可以在溶于水后,生成具有杀微生物活性的物质次氯酸(HClO)。次氯酸分子量小,并且具有强氧化性,在接触到新冠病毒后首先会氧化包膜蛋白使其变性,同时损害其蛋白质外壳,使其蛋白交联作用丢失,从而进一步破坏生物酶系统和遗传基因,使其失去活性。但乙醚在医学上属于麻醉剂,而且其蒸汽与空气可形成爆炸性混合物,遇到火/高热极易燃烧爆照,不能用于日常消毒。

过氧乙酸是强氧化剂,可将菌体蛋白质氧化而使微生物解体灭活,对微生物,包括芽孢有高效快速的杀菌作用。但过氧乙酸有强烈的刺激性气味,有急慢性制毒和致突变性质,属于易爆化学危险品,所以不用于日常消毒。

氯仿也叫三氯甲烷,可以溶解病毒的脂质外层从而使病毒灭活,但氯仿是一种有毒、有害的污染物,对人体有致癌性和麻醉性。在空气中遇到光照会产生有毒的光气,会损伤人的中枢神经系统以及肝肾功能的损害。吸入光气会产生精神错乱、反射消失,甚至昏迷、室颤,并且同时会损伤肝肾功能。误服时会产生胃部烧灼感,伴有恶心、呕吐、腹泻等症状。皮肤接触后也会造成严重的皮肤灼伤,所以不建议使用氯仿进行日常的消毒。

专家点评 

崔春丽,副主任护师

同济大学附属东方医院胶州医院院感科主任

目前,PCR实验室的消毒可分为消灭病原微生物和消灭扩增产物(防污染)两部分。从以上消毒机制可以看出,所有消毒办法均可用于病原微生物的消毒,但扩增产物的有效清除需要消毒用品有损伤或灭活DNA/RNA的机制,如有效氯、紫外线、过氧乙酸等,酒精是没有损伤核酸的能力的,所以不能用于清除核酸污染。因此,我们只有充分掌握各类消毒用品的消毒机制,才能在实际的消毒工作中得心应手。 

李玉杰,主任技师

同济大学附属东方医院胶州医院检验科主任

   无水乙醇是核酸提取试剂中最常用的核酸沉淀剂。乙醇与水相混溶,夺去DNA周围的水分子,使DNA失水易于聚合,但不会与核酸分子起任何化学反应,因此乙醇不能用于核酸污染的处理。PCR实验室生物安全一直是热门话题,实验室清洁消毒是主要手段,明确PCR实验室各区的消毒目的,科学合理进行物表空气的消毒,是每个检验专业技术人员应有的院感意识和业务素养。

参考文献:

[1]Hübner NO,Hübner C,WodnyM,et al. Effectiveness of alcohol- based hand disinfectants in a public administration: Impact on health and work performance related to acute respiratory symp- toms and diarrhea[J]. External Icon BMC Infect Dis,2010, 10: 250.

[2]Lee GM,Salomon JA,Friedman JF,et al. Illness transmission in the home: a possible role for alcohol-based hand gels[J]. Pediat- rics,2005,115( 4) : 852-860.

[3]汤全英,许圆. 一种稳定型含氯消毒湿巾的杀菌性能和稳定性研究 [J].中国消毒学杂志,2021,38(10):731-735.

[4]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化管理委员会.高效空气过滤器.北京:中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 , 中国国家标准化管理委员会 .2009

END

来源:检验之声

编辑:青翠欲滴

校审:晨晨

作者:检验之声

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