异基因 CAR-T的进展、挑战与未来方向

嵌合抗原受体 T（CAR-T）细胞疗法彻底改变了肿瘤免疫疗法，尤其是在血液系统恶性肿瘤方面，但自体 CAR-T 细胞的临床应用仍面临着高昂的成本和生产方面的重大挑战。而来自健康供者的通用型异基因 CAR-T 细胞为解决这些问题提供了有前景的方案，这些 “现货型”疗法可降低 CAR-T 生产的复杂性和成本。

基因编辑技术取得了令人兴奋的进展，临床试验数据也颇具前景，但仍存在一些重大挑战，包括移植物抗宿主病（GVHD）、宿主抗移植物反应（HVGR）、脱靶效应、基因毒性以及生产规模的可扩展性。

关键挑战与解决策略

GVHD

主因：供体TCR识别宿主HLA

核心方法：通过基因编辑敲除T细胞受体α恒定区（TRAC）基因，消除TCR表达，从而防止供者T细胞通过TCR识别宿主抗原引发GVHD。

辅助手段：结合磁珠分选去除残留的TCRαβ+细胞，进一步降低GVHD风险。

替代细胞疗法：

• CAR-NK细胞：具有MHC非依赖的杀伤机制，天然规避GVHD。

• 双阴性T细胞（DNTs）：在保持抗白血病效应的同时抑制GVHD。

• 其他：γδ T细胞、iPSC来源的细胞等。

药物策略：使用钙调神经磷酸酶抑制剂（如他克莫司）、抗胸腺细胞球蛋白（ATG）、JAK抑制剂（如芦可替尼） 等预防或治疗GVHD。

HVGR

主因：宿主免疫系统识别供体细胞

核心方法：清淋处理（如氟达拉滨+环磷酰胺方案）抑制宿主免疫系统。

基因编辑策略：

• 降低HLA表达：敲除β2-微球蛋白（B2M） 以抑制HLA-I类分子表达，避免宿主T细胞识别。同时，通过插入B2M-HLA-E/G融合基因来规避NK细胞的“missing-self”杀伤。

• 消除HLA-II类分子：敲除CIITA、RFX5等关键转录因子或HLA-II链基因（如HLA-DRA），或利用shRNA靶向CD74。

其他策略：

• 使用HLA配型相合的供者或建立HLA分型库。

• 优化CAR结构：使用人源化scFv或纳米抗体降低免疫原性。

• 表达同种免疫防御受体（ADR）：使CAR-T细胞能够反杀活化的宿主免疫细胞。

基因编辑技术

为解决上述挑战问题，诸如锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）、巨核酸酶、CRISPR 系统、碱基编辑和先导编辑等基因编辑技术正在进行探索，它们有各自的优缺点。

(A) 锌指核酸酶

一种人工嵌合核酸酶，基于Cys2-His2锌指基序组装成结构域阵列，特异性结合靶DNA，并招募FokI核酸酶结构域以诱导位点特异性DNA双链断裂。

(B) 转录激活因子样效应物核酸酶

与ZFNs类似，TALENs也需要成对设计以使FokI二聚化并切割所需DNA靶标。它们由中央DNA结合结构域（转录激活因子样效应物）、C端的FokI催化结构域和N端的核定位信号结构域组成。

(C) 归巢核酸酶 - megaTAL

MegaTAL是一种单体混合核酸酶，将TALE阵列与归巢核酸酶融合。这种组合能够提高在高度特异性靶序列上的切割活性，降低错配风险，并以极低的脱靶事件实现靶基因的高度精确编辑。

(D) 归巢核酸酶 - ARCUS

ARCUS源自同源二聚体I-CreI归巢核酸酶，是一种能够同时进行靶位点识别和切割的单体归巢核酸酶。它支持多重编辑，且脱靶率极低。

(E) CRISPR-Cas9

CRISPR-Cas9技术以其简单性、灵活性和高效性 revolutionized 基因编辑。它包含非特异性Cas9核酸酶（诱导DSBs）和识别20 bp靶序列的单链向导RNA。

(F) CRISPR 混合RNA-DNA/Cas9系统

与传统的sgRNA相比，使用混合DNA-RNA向导靶向位点可显著降低脱靶活性。这种DNA-DNA结合模式亲和力有限，便于在发生错配时及时阻止Cas9激活，同时不会干扰Cas9的靶向活性。

(G) Cas-CLOVER 系统

Cas-CLOVER系统的双引导策略相较于单引导CRISPR系统提高了其保真度。该系统包含两个dCas9，每个都与一个Clo051亚基融合。Clo051的激活需要其发生二聚化，而这依赖于每个亚基通过单独的sgRNA被引导至靶位点。

(H) 碱基编辑系统

碱基编辑器包含一个切口酶Cas9变体，与胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶连接，用于催化高度靶向的C→T或A→G碱基转换，并通过引入提前终止密码子或干扰剪接位点导致基因破坏，而无需产生DNA双链断裂。

(I) Prime编辑系统

nCas9也可以与逆转录酶融合，形成与特殊引导RNA（pegRNA）的复合物，用于在不产生DNA双链断裂的情况下，将更长的序列插入到DNA区域中。

细胞来源与亚群选择

血液肿瘤临床进展

血液肿瘤已开展多项临床试验。

B细胞恶性肿瘤（靶向CD19/CD20/CD22/BCMA）中，多项临床试验（如UCART19, ALLO-501, CTX110, CB-010, P-BCMA-ALLO1）证实了基因编辑同种异体CAR-T的有效性和可控的安全性（ORR可达48%-90%），GVHD发生率低，但CRS和感染仍是常见不良事件。

T细胞恶性肿瘤（靶向CD7/CD70）中，通过多重编辑（如敲除TRAC、CD7）解决“自相残杀”和GVHD问题，产品如BECAR-7、RD13-01、CTX130等在R/R T-ALL/TCL中显示出显著疗效（ORR 46.2%-81.8%）。

髓系恶性肿瘤（靶向CD123/CLL-1）中，UCART123、CB-012等产品正在探索中。

双靶点策略，如GC502（CD19/CD7）、UCART20x22（CD20/CD22）、CTA101（CD19/CD22）等，旨在降低因抗原丢失导致的复发风险。

实体瘤的挑战与策略

主要障碍：TME免疫抑制（TGF-β、PD-L1、MDSC、Treg）；CAR-T细胞浸润差；抗原异质性；靶抗原特异性不足。

解决策略：

• 基因编辑增强功能：敲除 PD-1、TGFBR2、Regnase-1；表达 IL-15、CXCR2、CCR4 等趋化因子受体。

• 联合治疗：放疗、溶瘤病毒、PD-1抑制剂。

• 智能CAR设计：可感应TME信号（如缺氧、ATP）启动激活

实体瘤的未来方向：

探索新靶点（如Claudin18.2, GPC3）。

开发联合策略（如与放疗、免疫调节剂、溶瘤病毒联用）。

智能化CAR-T设计：利用合成生物学设计感知并响应TME信号的“智能”CAR-T细胞。

体内CAR-T工程

•  颠覆性技术：通过靶向递送系统（如LNP、仿融合纳米囊泡-FuNV、改造的慢病毒载体） 直接将CAR基因/mRNA递送至患者体内的T细胞，实现原位编程。

•  优势：极大缩短制备时间、降低成本，实现“现货”治疗。

•  挑战：递送效率、靶向特异性、大规模生产和质量控制。

•  临床进展：已有研究（如ESO-T01）在多发性骨髓瘤患者中通过单次静脉输注实现了无完全清淋的体内CAR-T治疗，并获得100%客观缓解率。

参考文献

Su, J., Zeng, Y., Song, Z. et al. Genome-edited allogeneic CAR-T cells: the next generation of cancer immunotherapies. J Hematol Oncol 18, 90 (2025). https://doi.org/10.1186/s13045-025-01745-8