长篇综述：如何阅读AML和MDS的二代测序报告？血液科医生需要知道什么

急性髓系白血病（AML）和骨髓增生异常肿瘤（myelodysplastic neoplasms，简称MDS）是克隆性造血系统恶性肿瘤，二代测序（NGS）已成为其诊断、分类、风险分层和可测量残留病（MRD）监测不可或缺的一部分。传统的细胞遗传学和基于PCR的检测方法仍然有用，但靶向NGS panel现已成为标准诊疗方法，可快速、灵敏地检测复发性基因突变、结构变异和基因融合。全基因组、全外显子组和RNA测序以及长读长平台扩展了可检测变异的范围，但靶向panel在常规诊断中仍然最实用。生物信息学流程和质量指标——包括读长、测序深度和覆盖度——对于准确的变异识别至关重要，对于意义未明的变异或接近检测阈值的变异通常需要进行验证。

NGS现已嵌入诊断框架，包括WHO 2022和ICC分类，这些分类整合了诸如TP53、ASXL1、RUNX1和FLT3等复发性突变基因。这些数据为预后模型提供了依据，其中ELN-2022为接受强化化疗的患者定义了不良风险的AML亚组。针对接受低强度治疗患者的ELN-2024 AML，以及通过整合突变数据细化MDS风险类别的IPSS-M。NGS也使得MRD监测成为可能，基因panel和PCR-NGS混合方法（例如用于FLT3-TID）显示出日益增长的临床实用性，尽管仍缺乏标准化。此外，诊断性NGS经常发现胚系易感综合征（例如，DDX41、GATA2），对治疗决策和移植供者选择也具有重要影响。

《Journal of Clinical Medicine》近日发表综述，回顾了NGS在AML和MDS临床管理中的优势、局限性和未来前景，特别强调了其在这些疾病中应用的生物学和技术原理；讨论了NGS结果如何在当前临床框架内影响诊断、预后分类和治疗决策。总的来说，该文章全面概述了NGS基础知识，以支持临床医生在日常实践中应对日益复杂的分子数据。现翻译供参考，全文2.1万字，建议收藏后慢慢看。

引言

急性髓系白血病 (AML) 和骨髓增生异常肿瘤 (缩写为MDS) 是克隆性造血系统肿瘤，在96%的病例中至少存在一种体细胞突变。尽管WHO第五版仍然允许在缺乏定义性遗传异常的情况下基于分化进行AML诊断，并且MDS中的发育不良仍可能对应于形态学标准，但在这两种疾病中，诊断越来越依赖于旨在识别特定遗传特征的广泛实验室检查。在此背景下，经典的基于PCR和细胞遗传学的技术已迅速被二代测序 (NGS) 所补充。现在，对所有AML患者进行基于NGS的突变谱分析已成为标准诊疗，直接影响治疗选择和预后判断。实际上，NGS能够对数百万个DNA片段同时进行测序，为肿瘤细胞的基因组结构、遗传变异、基因表达谱和表观遗传改变提供全面的见解。然而，NGS在AML/MDS中的广泛可用性和成本降低也增加了血液科医生和患者解释测序报告中日益增长的分子信息量的不确定性。

NGS技术

NGS基于大规模平行测序原理，其中数百万个DNA片段被同时测序。根据临床和研究需要，可以采用不同的NGS方法，允许对全基因组、外显子组或转录组进行测序。全基因组测序 (WGS) 提供遗传变异的完整图景；全外显子组测序 (WES) 专注于蛋白质编码区域；RNA测序有助于识别融合基因；而靶向测序panel在临床实践中应用最广泛，专注于MDS和AML中复发性突变的一组基因。

NGS工作流程

典型的NGS工作流程包括从样本中提取DNA或RNA，通过片段化和接头连接（如杂交捕获法）或基于扩增的检测中的靶标富集进行文库制备，然后进行测序。

在杂交捕获中，DNA被随机片段化，测序接头被连接到末端。然后使用生物素化的探针选择性分离目标区域。

相比之下，扩增子测序依赖于专门设计的引物通过PCR扩增特定靶标，然后添加接头以准备扩增产物用于测序。

这两种方法之间的选择取决于几个因素，例如靶标数量、工作流程复杂性和每个样本的成本。

在这两种方法中，除了测序仪器所需的接头外，还加入了患者特异性的索引序列。这些索引允许多个文库在同一个测序运行中合并，从而能够同时分析多个样本，甚至是来自不同患者的样本。

不同的平台依赖于不同的测序技术，包括合成测序、杂交测序、连接测序和基于电阻抗的序列检测。临床实践中最常用的是合成测序 (SBS)，由Illumina仪器采用，其中荧光标记的核苷酸被实时掺入和检测。SBS的一种基于半导体的变体，由Ion Torrent系统使用，检测核苷酸掺入后释放的H⁺离子，而不是荧光。这两种方法都需要在测序前扩增DNA片段：Illumina平台使用桥式扩增，其中片段被加载到流动池上，在那里它们折叠形成桥，而Ion Torrent在将片段单独结合到磁珠后进行扩增。

最近出现了长读长测序技术。Pacific Biosciences（美国加利福尼亚州门洛帕克）的单分子实时测序 (SMRT) 可产生高度准确的"HiFi"长读长，而纳米孔测序 (Oxford Nanopore Technologies，英国牛津) 则测量核酸通过蛋白质孔时的离子电流变化，从而实现超长读长和实时分析。虽然短读长SBS仍然是常规AML和MDS诊断的金标准，但长读长平台也越来越多地被探索用于检测结构变异、融合基因和转录本亚型。在这些情况下，不需要扩增，因为核酸片段可以直接测序。

然后，生物信息学流程将读段与参考基因组比对、识别并注释变异，并生成可解释的数据。与参考基因组比对后的关键生物学指标（不包括运行质量检查）包括读长、测序深度和覆盖度、重复率、检测限 (LoD)、CG偏好性，因为富含GC的片段可能显示出较低的覆盖度，以及一些其他特定检测参数，将在下面简要描述。在临床环境中，结果通常需要验证，并且变异解释必须整合等位基因频率、功能注释和临床意义。

对于NGS，一个读段代表在测序过程中从一个DNA或RNA片段获得的核苷酸序列。读长因平台而异，但在临床肿瘤学和血液学中，大多数靶向DNA和RNA panel产生的读长为50-300 bp（通常为100-250 bp），这足以检测点突变、小插入缺失和基因融合。然而，短读长可能会限制对长插入（例如一些FLT3 ITD变异）或长缺失（例如CALR 1型突变）的精确检测。全基因组测序和长读长技术可以生成长读长，通常在10-100千碱基范围内，有时达到几兆碱基，从而能够检测结构变异、复杂重排和全长转录本亚型。从技术上讲，读段也可能无法唯一比对、无法比对，或者在RNA-seq中，比对到无信息的转录本。

NGS平台包括内置的读段质量度量，确保变异检测的高准确性。

测序覆盖度表示参考区域（基因组、外显子组、转录组或靶向基因panel）至少被测序一次的比例。覆盖不足可能导致错误或不确定性，使得难以区分真实的遗传发现和技术假象，并使下游生物信息学分析复杂化。某些片段，如富含GC的区域、多倍体基因或非常罕见的变异，可能需要更高的测序深度或覆盖度。

测序深度是指在一次NGS运行中，DNA或RNA样本中每个核苷酸被读取的平均次数，通常以倍数表示（例如，100×）；更高的深度增加了变异检测的可信度。对于RNA-seq和靶向RNA测序，报告每个样本的总读段数至关重要，因其强烈影响基因表达分析的灵敏度、融合转录本的检测和低丰度亚型的识别。在人类全转录组 (mRNA) RNA-seq中，通常每个样本2000-3000万读段就足够了，建议3000-5000万读段以获得更高的灵敏度。检测低表达转录本或详细剪接可能需要显著更深的测序，而靶向RNA panel由于其聚焦的设计，每个样本可能只需要100-300万读段。

不同类型的NGS可实现不同的测序深度。通常来说，WGS提供的测序深度范围为30-60×，而仅外显子组的WES覆盖深度范围约为100-200×，这对于检测低频变异可能不足。相比之下，靶向基因panel专注于较小的基因组区域，可实现更高的测序深度（通常为500-1000×），提高对罕见变异的灵敏度。

可靠检测低频变异所需的测序深度仍然是NGS诊断中的一个关键问题。分子病理学协会和美国病理学家学院 (AMP/CAP) 的指南建议，对于靶向肿瘤panel中的常规体细胞变异检测，每个扩增子的最小覆盖率应>250×，通常能够检测变异等位基因频率 (VAF) 为5%的变异。VAF代表报告特定变异的读段数相对于覆盖该基因位点的总读段数的比例。然而这个阈值并不能确保对极低VAF或诸如最小残留病监测等应用的灵敏度。事实上，几项研究表明，需要显著更高的覆盖率才能有信心地检测低VAF变异：例如，Petrackova等人表明，以>99%的置信度检测3%的VAF大约需要1650×的覆盖率，而稳健检测2%的VAF通常需要接近或高于1000×的测序深度。靶向测序panel可以实现高灵敏度，因为特定基因组区域的选择性扩增富集了文库中包含变异的位点，从而允许更深覆盖度而无需过度的测序量。

除了测序深度和VAF之外，大多数NGS协议还需要最小数量的支持读段——即包含变异等位基因的单个测序读段。这一要求对于区分真实变异与测序假象至关重要，特别是在低VAF时。在临床和研究实践中，通常应用大约10-30个支持读段的阈值，以确保可靠的变异识别并减少假阳性数量。对于融合检测，通常至少需要3个支持读段。

临床实践中的NGS类型

全基因组测序 (WGS)可提供遗传变异的全面视图，捕获编码和非编码区域以及结构变异和拷贝数改变，在基因组分析中提供了无与伦比的广度。相比之下，全外显子组测序 (WES) 仅靶向蛋白质编码外显子（约占基因组的1-2.5%）提供了一种更具成本效益的方法，同时仍能检测到高比例的临床相关变异。

RNA测序 (RNA-seq或全转录组测序) 对于识别融合基因以及捕获基因表达谱和转录组改变特别有价值，这些可能被DNA-based检测所遗漏。RNA-seq也可能需要用于定义生物显性基因（如KM2TA重排 (例如KMT2A::MLLT3、KMT2A::MLLT1、KMT2A::ELL)）的特定融合伴侣，这些重排具有预后意义，并且无法单独用细胞遗传学检测（如FISH）完全解析。

最后，靶向测序panel（临床诊断中最广泛使用）专注于特定疾病中复发性突变的一组选定基因（对于MDS和AML，通常为20-50个基因），以更低的成本和更快的周转时间提供更高的覆盖度和分析灵敏度。通过选择性扩增感兴趣的区域，靶向panel增加了文库中相关序列的相对代表性，减少了对极高总体测序深度的需求，并允许检测具有相对较低VAF的变异。靶向panel可以检测临床相关的单核苷酸变异 (SNV)、小插入和缺失 (indels)、拷贝数改变、融合基因和结构变异，支持诊断，提供更精确的预后定义并指导治疗选择。值得注意的是，靶向测序panel对检测大插入或缺失（例如FLT3-ITD、MLL PTD和52 bp CALR 缺失）的灵敏度可能有限，这些可能需要更复杂的生物信息学方法或互补的分子诊断检测。这种局限性源于这些改变的大和/或可变大小与NGS读段相对较小大小 (50-300 bp) 之间的差异。然而，最近的临床试验表明，这些挑战可以通过基于PCR-NGS的方法来克服，甚至可以实现FLT3-ITD MRD的个性化测量。另一方面，高GC含量的基因组区域，如CEBPA变异，可能在文库制备过程中难以扩增，可能需要更高的测序深度以确保可靠检测。然而，这些问题也可以通过使用为AML诊断设计的长读长NGS靶向panel来解决。最近的研究表明，高诊断灵敏度和与靶向NGS panel传统分析方法的高度一致性，产生具有改进扩增子特异性的靶标富集文库，使其适用于准确的FLT3-ITD和CEBPA检测。

大多数靶向panel已根据最新的WHO/ICC 2022分类进行了修改，增加了新的相关基因。通常建议纳入髓系恶性肿瘤panel的核心基因通常包括：NPM1、CEBPA、ASXL1、BCOR、EZH2、RUNX1、SF3B1、SRSF2、STAG2、U2AF1、ZRSR2、TP53、JAK2、CALR、MPL、CSF3R、KIT、FLT3 和 IDH1/2。许多panel也经常包含ETV6、KRAS、NRAS和 WT1（表1）。

然而，靶向panel中包含的基因数量（核心和/或额外靶点）以及特定的基因片段（例如热点突变、侧翼区域、编码或非编码序列，或整个基因覆盖度）在不同的实验室之间可能存在显著差异，特别是在缺乏标准化的AML/MDS诊断NGS方法的情况下。

采样类型和数量

对于大多数血液学样本，包括MDS或AML，肿瘤细胞可从骨髓或外周血中获得（图1）。

对于骨髓增殖性肿瘤，外周血NGS通常与骨髓结果高度一致，使其成为一种可靠且侵入性较小的诊断工具，但对于MRD测量，骨髓样本仍然优于外周血样本。白细胞计数或流式细胞术可用于估计样本中的肿瘤细胞数量。当无法获得骨髓抽吸物时，也可以使用福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 的骨髓环钻活检组织进行NGS。然而，FFPE样本的测序质量通常低于新鲜样本，因为甲醛固定会诱导细胞大分子和DNA碱基氨基之间的交联，降低DNA样本质量。所需的样本量因检测和研究而异。Illumina建议每个样本大约80 ng的总DNA或RNA，但使用更小的输入量 (40-60 ng) 或当可用时更高的量 (100-120 ng) 通常也能获得良好结果。一项比较FLT3-ITD和CEBPA检测诊断panel的研究报告称，每个样本需要200 ng DNA用于最佳文库制备。长读长和超长读长NGS检测可能需要更大量的DNA，范围从几百纳克到微克。表2总结了按具体临床问题分组的主要NGS检测。

结果验证

由于NGS工作流程的复杂性以及技术假象、生物信息学错误或接近检测阈值的极低水平变异导致假阳性的风险，NGS结果可能需要使用其他分子方法进行确认，如Sanger测序、液滴数字PCR、定量PCR或毛细管电泳。分子病理学协会 (AMP) 和美国病理学家学院 (CAP) 的现行指南建议在特定情况下进行正交确认——例如，当结果不明确、接近检测限、分类为意义未明变异 (VUS)，或当其具有直接治疗影响时。对于经过充分验证、高性能的靶向NGS panel，鉴于其与其他分子诊断方法的高度一致性，通常不需要对复发性热点突变进行确认。总体而言，验证策略应根据检测设计、变异类型和临床背景进行调整，旨在平衡分析可靠性与周转时间和成本。

标准化

将NGS整合到血液系统恶性肿瘤的诊断工作流程中，凸显了跨实验室和平台标准化的必要性，测序化学、文库制备、生物信息学流程和报告的差异均会影响变异检测和解读。来自AMP和CAP的国际指南建议，从样本采集和核酸提取到文库制备、测序性能指标（读长、覆盖深度、均一性、错误率、变异等位基因频率）以及分析后步骤（变异注释、分类和报告）都要协调程序，能力验证计划和室间比较也用于确保可重复性和临床可靠性。尽管ELN 2022 AML建议、ESMO MDS临床实践指南以及WHO 2022和ICC 2022诊断分类都强调了将NGS整合到AML和MDS的诊断和预后工作流程中，并定义了相关基因的最小集合，但诊断性NGS缺乏标准化限制了其在临床实践中的常规实施。在就最小基因panel达成共识、定义临床相关变异的检测限以及标准化NGS用于MRD监测方面仍然存在挑战。此外，几年前发布的现有指南应更新以反映自那时起进入临床实践的最新技术进展。值得注意的是，意大利最近发布了针对成人AML中包括NGS在内的先进分子诊断学作用的特定SIES指南，其他国家也发布了类似建议。

遗传改变的类型

NGS能够检测单核苷酸变异 (SNVs)、小插入和缺失 (indels)，并且根据平台不同，还能检测拷贝数变异 (CNVs) 和结构重排。基于RNA的测序也能检测融合转录本，这在AML中尤其重要。

使用标准化和一致的命名法以确保清晰的沟通和有效的数据共享非常重要。人类基因组变异学会 (HGVS) 提供了广泛接受的变异命名指南，建议在临床报告中使用。报告应指明使用的参考序列，以及编码和蛋白质命名法，以便于功能解读。对于编码变异，应使用每个基因最长且经过验证的参考转录本，并明确标示。

常用的参考数据库包括RefSeq (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq)、Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html) 和 Locus Reference Genomic (LRG)。

结果解读

生物信息学分析可分为三个主要阶段：

-初级分析：

测序过程中产生的荧光信号被转换为代表单个碱基序列的文本文件 (FASTQ)。

-二级分析：

根据索引将多个样本一起运行的序列分开，这个过程称为"解复用"（demultiplexing）。然后将读段与参考基因组进行比对，并在称为"变异识别"的步骤中检测差异。

这个过程可以识别成千上万的变异，这些变异被收集到每个患者的一个VCF ("Variant Call Format") 文件中。

-三级分析：

最后阶段涉及在临床背景下解读已识别的变异，评估其潜在相关性和致病性，并确定与患者疾病的可能因果关系。

变异可以根据其可操作性或致病性进行分类。

目前，有两个主要系统用于分类体细胞变异的临床意义：AMP/ASCO/CAP分层系统和ClinGen/CGC/VICC系统。

在第一个系统中，体细胞变异根据其对于癌症诊断、预后和治疗的临床相关性分为四个层级：Tier I包括具有强临床意义的变异；Tier II包括具有潜在临床意义的变异；Tier III指临床意义不确定的变异；Tier IV包括良性或可能良性的变异。

第二种分类基于对多个标准的综合评估，包括人群频率数据、计算或预测算法结果，以及变异是否影响蛋白质的重要功能域。重要的是，没有单一标准足以单独确定变异的致病性；相反，致病性必须得到多方面的证据支持。这种综合方法使得变异能够被分为五类：1—良性；2—可能良性；3—意义未明的变异；4—可能致病；5—致病。

根据现有科学证据的强度和范围，致病性标准进一步分为：致癌性非常强 (OVS1)、强 (OS1-3)、中等 (OM1-4) 或支持性 (OP1-4)。二良性标准分为：体细胞良性非常强 (SBVS1)、强 (SBS1-2) 或支持性 (BP1-2)。图2展示了"如何阅读NGS报告"的建议实用算法。

有用的数据库

随着包括血液系统恶性肿瘤在内的各种癌症类型的大规模基因组测序项目的数量不断增加，大量的数据已经被生成并整合到多个数据库中。

特定变异的临床和生物学意义与其在癌症背景中的复发率密切相关，因此使用数据库和已发表的文献评估在不同肿瘤实体中发现的肿瘤变异的发病率和患病率至关重要。对于体细胞变异的注释，有几个专门的癌症数据库可用，包括 Cancer Gene Census (http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/census/)、体细胞突变目录 (COSMIC; http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/) 和 The Cancer Genome Atlas (TCGA; http://cancergenome.nih.gov/)。这些数据库提供不同癌症类型和亚型中序列变异的信息、与其他基因组数据库的交叉引用，以及包括已发表文献、细胞通路、靶向治疗、临床试验和结果数据的引用。

可能与癌症易感综合征相关的可能的胚系变异可在肿瘤样本测序过程中检测到。尽管如此，将这些数据与肿瘤细胞含量相关联非常重要。

在这方面，查阅专门的数据库可能是有用的，例如在线人类孟德尔遗传 (OMIM, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim) 和人类基因突变数据库 (HGMD, http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)，这些数据库提供有助于评估这些变异潜在性质的信息。其中ClinVar (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar)被广泛使用，它编目了不同组织中的胚系变异，并将其从致病性到良性进行分类。ClinVar 还提供支持的临床证据、相关研究和专家小组分类，偶尔会报告某些变异的体细胞发生情况。

当怀疑变异具有胚系性质时，通过经验证的胚系测试进行确认是合适的。应在未受最初请求进行体细胞分析的疾病影响的组织样本上进行，遵循与医生协商并在获得患者适当填写和签署的知情同意书后进行。

因此，建议报告明确指出，在怀疑有肿瘤基因变异起源于胚系的情况下，该检测无法可靠地区分体细胞变异与胚系或良性变异。

为了评估变异在大人群中的频率，使用人群数据库。这些资源提供在大规模队列中特定基因座上等位基因频率的信息，通常按不同亚群分层。使用这些数据库时，有必要考虑队列是否包括健康或患病个体，是否包括来自同一家族的多个个体，以及受试者的年龄范围。人群数据库通常用于表征良性变异，基于任意的截断值（次要等位基因频率，MAF）。没有标准化的 MAF 阈值：通常推荐 1% 的阈值，并可能根据患者的具体种族进行调整。最广泛使用的人群数据库包括以下：1000 基因组计划 (http://browser.1000genomes.org)、外显子组变异服务器 (http://evs.gs.washington.edu/EVS )、dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)、dbVar (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbvar) 和 ExAC (http://exac.broadinstitute.org/)。

最后，在评估基因中的变异时，通常会使用计算机预测算法来评估其对剪接以及对编码蛋白质结构和功能的潜在影响。这些算法通常考虑几个关键因素，包括氨基酸或核苷酸残基的进化保守性、基于理化特性的氨基酸替代的生物化学后果，以及变异在翻译蛋白质中的位置。

一些最常用的计算机工具包括 PolyPhen2 Ver. 2.2.3 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2)、SIFT 或 PROVEAN v.1.1.3 (http://sift.jcvi.org)、MutationTaster v. GRCh37/Ensembl 69 (http://www.mutationtaster.org) 和 CADD v1.6 (https://cadd.gs.washington.edu/)。

重要的是要强调这些工具是预测性的，在将测序变异作为临床决策的唯一证据进行解读时应谨慎使用。

报告的结构

在 NGS 分析过程结束时，必须准备一份全面的报告来总结结果。这份报告应该详尽，提供所用方法的必要技术细节，同时让非专业医疗保健专业人员和患者能够理解，并且足够简洁，避免用过多信息使读者不知所措。报告必须包括执行分析的实验室信息、患者的个人信息、样本的可追溯性、解决的临床问题、识别的变异及其解读，以及分析所采用的方法。

报告清楚显示带有认证（例如，UNI EN ISO 9001）和认可（例如，UNI EN ISO 15189, UNI CEI EN ISO/IEC 17025）的实验室名称很重要。报告最好包括主任姓名、实验室联系信息，以及转诊临床医生姓名和来源科室，确保责任清晰和可追溯。

报告包含患者的个人信息很重要，例如姓氏、名字、出生日期、性别和种族。

报告还必须提供生物样本的详细信息，包括唯一标识符、采集日期和样本类型（例如，外周血、骨髓），并尽可能提供其他信息，如原始细胞百分比的估计、诊断和/或检测的临床指征。

报告必须包括所用 NGS 检测的详细信息，说明测序技术或平台、panel 名称和版本，以及分析的基因列表和覆盖区域。

还应提供方法学及其局限性的简要描述，并应包括用于生成结果的所有软件工具及其版本号的列表，以及所使用的参考基因组 (GRCh37-hg19 或 GRCh38)。

重要的是要指出该方法的局限性：说明该方法无法检测哪些类型的变异，哪些改变不会被报告，它们潜在的致癌性/良性，或临床可操作性。报告可以包括每个样本达到的总体覆盖度，以整个测序基因组区域的平均覆盖度来衡量。根据 AMP/CAP 指南，建议平均覆盖度至少为 250× 以可靠地检测体细胞变异。在此背景下，通常使用 5% 的 VAF 阈值进行变异识别，并应在报告中明确说明。

结果部分是报告的核心组成部分。为了清晰起见，最好按照临床相关性顺序呈现变异，将最具致病性或可操作性的变异列在前面。

所有报告的变异必须使用 HGVS.c 和 HGVS.p 命名法进行描述，连同它们的 VAF 和分类。识别的变异应在一个专门的部分进行总结，结构清晰以确保立即理解，并在适当时补充相关文献的引用。报告以报告日期、进行分析的生物学家全名和实验室负责人的签名结束。报告的每一页都必须适当编号（图 3）。

NGS vs. 定量PCR vs. 数字PCR

如今的实验室可以使用多种技术，可以单独使用或组合使用来实现其实验目标。这些方法包括长期建立的方法，如定量 PCR (q-PCR)，以及更新的技术，如数字 PCR (dPCR) 和 NGS。

qPCR 允许通过荧光监测实时测量 DNA 扩增，提供相对或绝对定量。

在 dPCR 中，样本被分成数千个独立分区：显示荧光信号的阳性分区数量与总分区数量的比率用于计算样本中靶标的浓度。这种方法允许绝对定量，能够检测非常低数量的靶分子，不受 PCR 抑制剂的干扰，并且不需要标准曲线，使其成为一种灵敏且准确的技术。尽管 qPCR 分辨率更有限，但它仍然是一种更快、更具成本效益的方法，适用于同时分析多个样本和靶标。qPCR 和 dPCR 都需要预先了解感兴趣的突变，可进行纵向监测。

相比之下，NGS 支持大规模定量和定性分析，能够同时研究多个样本中的多个突变。这种方法生成的分析数据量更大、更复杂，成本和报告时间增加，并且通常灵敏度低于 dPCR。

NGS对诊断和分类的影响

NGS在MDS中的作用：从诊断到分类

从前一版WHO2016到更新的ICC 2022和WHO第5版的转变，标志着新的遗传定义的MDS类别的引入。在此背景下，NGS检测的可用性不仅对正确识别患者类别至关重要，而且对于将患者导向基因驱动的治疗也至关重要。WHO第5版的主要创新之一是定义了MDS伴低原始细胞计数和SF3B1突变，已纳入以前的MDS LB伴环状铁粒幼细胞 (RS) 类别。这一新类别也被ICC分类采用，取代了之前的MDS伴RS。WHO-2022还引入了另一个遗传驱动的类别，定义为MDS伴双等位基因TP53突变，与原始细胞计数无关。同样，ICC引入了MDS和MDS/AML伴TP53突变的诊断类别，根据原始细胞百分比进行区分。新的"MDS/AML"类别代表一个重叠组，包括原始细胞为10%至19%的病例，取代了以前的WHO MDS伴原始细胞增多2型类别。这一变化更好地反映了MDS和AML之间的生物学连续性。NGS对于定义MDS/AML至关重要，因为必须识别或排除几种突变以确保准确分类。特别是，MDS/AML病例不应携带AML定义性遗传异常，如NPM1或CEBPA。ICC进一步将MDS/AML细分为：(i)MDS/AML伴突变TP53，(ii)MDS/AML伴骨髓增生异常相关基因突变或细胞遗传学异常，和 (iii) MDS/AML，非特指 (NOS)。重要的是，正确的分类需要对包括TP53、ASXL1、BCOR、EZH2、SF3B1、SRSF2、STAG2、U2AF1、ZRSR2 和RUNX1在内的几个基因进行突变评。最后，WHO 2022和ICC分类都对克隆性造血相关方面进行了相关更新，包括正式承认意义未明的克隆性造血 (CHIP) 和意义未定的克隆性血细胞减少 (CCUS) 作为髓系肿瘤谱系的一部分。

CHIP和CCUS中NGS的作用

CHIP目前定义为存在血液系统恶性肿瘤中常见的体细胞突变（例如，DNMT3A、TET2、ASXL1），且个体无血细胞减少或发育不良。这种情况在通过NGS检查其他方面健康的个体中越来越多地被检测到，并且在老年人中更常见。多项研究表明，患有CHIP的个体患血液系统恶性肿瘤的风险增加，特别是MDS和AML，以及患动脉粥样硬化性心血管疾病的风险更高。通常认为变异等位基因频率≥2%对于CHIP有显著意义。虽然CCUS在WHO 2022中未被确认为一个诊断类别，但ICC分类将其定义为独立的诊断实体，需要密切的临床随访，特别是在检测到像TP53这样的高危突变时。根据ICC，CCUS定义为至少一个谱系的持续性不明原因的血细胞减少，不存在形态学发育不良或原始细胞增多。NGS对于此诊断至关重要，因为它能够检测到髓系肿瘤中常见的至少一个体细胞突变（例如，DNMT3A、TET2、ASXL1、SF3B1、SRSF2 等）。在这些情况下，突变类型和VAF尤其重要。CHIP通常无症状，每年有1%的风险进展为血液系统恶性肿瘤。然而，多项研究已经确定了CHIP的几个高危特征，包括特定突变（TP53、U2AF1、SRSF2、IDH1/2）、存在多个共存突变、检测到较大的克隆（例如VAF 10–15%）或随时间推移的克隆扩增。在CCUS中，与典型的CHIP突变相比，剪接体基因和表观遗传调节因子的突变与更高的进展风险相关。此外，存在≥2个致病性突变在5年内导致约50%的进展风险。

MDS中新的基于遗传学的类别

MDS中的SF3B1

SF3B1（剪接因子3b亚基1）是SF3B复合物的最大亚基，是U2 snRNP的核心组成部分，在剪接体组装的早期阶段在分支位点识别中起关键作用。SF3B1 突变最初于2011年被发现，并在所有谱系的髓系恶性肿瘤中观察到，包括MDS、MDS/AML和AML。然而，它们在MDS中尤其富集，特别是在MDS伴RS中，高达65%的患者携带SF3B1突变。几项研究证实，在≥5%环状铁粒幼细胞的MDS病例中，检测到SF3B1突变的比例超过90%。大多数SF3B1突变是聚集在外显子12–15的杂合错义变异，其中K700E约占变异的三分之一。这些突变改变了蛋白质功能，但通常保留其结构完整性。根据ICC分类，伴SF3B1突变的MDS现被确认为一个独立的诊断实体，不再要求存在环状铁粒幼细胞。为了满足诊断标准，伴SF3B1突变的MDS患者骨髓中原始细胞必须<5%，外周血中<2%，并且不能携带特定的细胞遗传学和分子异常，包括孤立del(5q)、-7/del(7q)、abn3q26.2或复杂核型、TP53 多打击或RUNX1突变。WHO 2022更为保守，对于野生型SF3B1且≥15%环状铁粒幼细胞的病例，仍保留伴MDS伴低原始细胞和环状铁粒幼细胞的实体。该类别代表一个遗传学上同质的组，当在低原始细胞计数且无额外遗传改变的患者中检测到时，与低进展率和更好的总生存期 (OS) 相关。

MDS中的TP53

TP53是一个位于染色体17p13.1的抑癌基因，是人类癌症中最常发生突变的基因之一，其失活通常与不良临床结局相关。在MDS中，致病性TP53改变在7-11%的病例中被发现。重要的是，MDS中的TP53失活不仅限于点突变，还可能涉及其他遗传物质丢失的机制，包括拷贝中性杂合性丢失和节段性缺失，这些进一步导致抑癌功能的丧失。大多数TP53突变 (~80%) 是涉及外显子5至8的错义替换，导致氨基酸改变，而其余病例包括截短性改变。生理上，活化的p53调节超过150个参与DNA损伤修复、凋亡、衰老和细胞周期停滞的基因转录。功能丧失性突变导致p53蛋白功能丧失，损害基因组稳定性，破坏造血干细胞自我更新，并促进不受控制的增殖。在WHO 2022分类中，引入了一个独特的诊断类别，称为"MDS伴双等位基因TP53失活(MDS-biTP53)"，定义为存在导致p53功能完全丧失的多个TP53改变。双等位基因TP53(biTP53) 改变可能包括多个突变、VAF > 50%的突变，或伴随另一个等位基因缺失（TP53 拷贝数丢失或拷贝中性杂合性丢失）的突变。检测TP53的双等位基因失活是复杂的，需要不止一种技术。NGS分析对于检测基因中的单个突变或多个突变至关重要，至少覆盖外显子4至11。检测TP53位点遗传物质丢失的一线方法是使用针对17p13.1上TP53基因座的特异性探针组进行荧光原位杂交。相比之下，NGS有助于识别多打击TP53改变。具体而言，存在多于一个TP53突变通常提示双等位基因受累，表明双等位基因失活；其次，检测到VAF ≥ 50%的TP53突变可作为第二个TP53等位基因丢失的替代指标（尽管不确定）。因此，NGS通过提供支持识别TP53双等位基因失活的突变数据来补充FISH。同时，NGS panel可能无法检测到低细胞分数中存在的17p缺失，而这些缺失更容易被FISH识别，这也解释了两种方法在TP53改变检测上的差异，并支持它们的互补使用。ICC分类引入了两个不同的伴TP53突变的MDS类别：MDS伴TP53突变和MDS/AML伴TP53突变。第一种包括原始细胞高达9%的MDS病例，伴有要么是多打击TP53突变，要么是TP53突变 (VAF > 10%) 和通常伴随17p丢失的复杂核型。多打击TP53突变包括存在两个不同的TP53突变（每个VAF > 10%）、单个TP53突变伴有17p缺失或在TP53基因座发生拷贝中性LOH，或TP53突变体VAF > 50%。伴突变TP53的MDS/AML定义为原始细胞为10-19%且任何TP53突变VAF > 10%的病例。总体而言，这些TP53突变MDS类别，特别是多打击TP53，通常与复杂核型和不良预后相关。

NGS对AML定义的影响，新的遗传学分类

如今，AML可以根据两个系统进行分类：髓系肿瘤和急性白血病的WHO第五版或ICC。遗传学特征现已超越形态学和细胞测量学特征，牢固确立了NGS分析在AML诊断中的基石地位。ICC分类通过将携带复发性遗传异常（BCR::ABL1 除外）的病例的原始细胞阈值降低到10%，加强了遗传学的作用。此外，ICC在原始细胞为10%至19%的病例中引入了MDS/AML类别。ICC的方法可视为分层次的。第一步应研究复发性遗传异常、NPM1 突变和CEBPA 的框内bZIP结构域突变，如果不存在，第二步需要评估TP53 突变 (VAF>10%) 和骨髓增生异常相关基因突变或细胞遗传学异常。因此，ICC的第二步几乎完全依赖于NGS来识别和量化TP53 突变，以及检测ASXL1、BCOR、EZH2、SF3B1、SRSF2、STAG2、U2AF1、ZRSR2 和RUNX1 突变（骨髓增生异常相关基因）。

AML中的TP53突变

在de novo AML中，TP53 突变在5-10%的病例中被检测到，且在老年患者和治疗相关AML中更常见。类似于MDS，TP53 突变可以单等位基因或双等位基因形式存在；在后一种情况下，第二个等位基因的失活可能通过额外的点突变、拷贝中性LOH (cnLOH) 或杂合性丢失 (LOH) 发生。TP53 突变可定义一个侵袭性AML亚群，包括de novo、从先前MDS进展而来或治疗相关，并且它们通常与复杂核型相关。与MDS不同，在ICC分类中，单个TP53 突变且VAF>10%就足以定义伴TP53 突变的AML（原始细胞>20%）或伴TP53 突变的MDS/AML（原始细胞10-19%）。

MDS相关突变

ICC分类以及ELN2022指南引入了一个九基因特征（ASXL1、BCOR、EZH2、RUNX1、SF3B1、SRSF2、STAG2、U2AF1 和ZRSR2）来定义新的伴骨髓增生异常相关突变AML（原始细胞>20%）或MDS/AML（原始细胞10-19%）类别。这些突变在ELN 2022中被归类为高危，因为它们与先前MDS或慢性粒单核细胞白血病 (CMML) 继发的AML有强烈关联。在ICC分类中，此类别与MDS相关细胞遗传学异常一起被纳入，从而扩展了以前的WHO 2016类别"AML伴骨髓增生异常相关改变"，该类别仅基于形态学评估。WHO第5版也认可AML，骨髓增生异常相关的WHO-AML-MR类别，由特定的分子和细胞遗传学异常定义，同时仍包括从MDS或MDS/MPN进展而来的AML病例。值得注意的是，WHO第5版仅包括ICC分类中使用的九个基因中的八个，排除了RUNX1。这八个基因对识别从先前MDS进展而来的继发性AML保持超过95%的特异性，从而有助于区分继发性AML与de novo AML。更具体地说，SRSF2、SF3B1、U2AF1 和ZRSR2 在近半数继发性AML病例中发生突变，编码对于RNA加工（特别是前体mRNA剪接）至关重要的剪接体成分。大多数SRSF2 突变影响P95残基，而SF3B1 突变主要发生在K700，一小部分涉及K666。U2AF1 基因在S34F和Q157处也显示出明确的突变热点。相比之下，ZRZS2 突变分散在整个基因中，但最常发生在Pre-ZF1 (49%)、UHM (27%) 和Post-ZF2 (13%) 结构域。ASXL1、EZH2 和BCOR 属于染色质修饰因子类。ASXL1通过与Polycomb复合物蛋白以及各种转录激活因子和抑制因子相互作用来调节表观遗传程序和转录。该基因在髓系肿瘤中普遍发生突变，大多数变异发生在最后一个外显子（外显子13），其中最常见的改变之一是移码突变G646Xfs*12。EZH2是一种赖氨酸甲基转移酶，是Polycomb抑制复合物2 (PRC2) 的核心蛋白。大多数突变聚集在蛋白质C末端的SET ([Su(var)3-9, Enhancer-of-zeste and Trithorax]) 或CXC (富含半胱氨酸区域) 结构域，这些区域对其甲基转移酶活性至关重要。大约一半的变异是终止获得或移码突变，导致蛋白质提前截断。BCOR 是一种参与胚胎发生、间充质干细胞功能、造血和淋巴发育的转录因子。它充当肿瘤抑制因子，致病性变异可能发生在整个基因中，包括无义、移码、错义或剪接位点突变。STAG2是黏连蛋白复合物的核心成分，对染色质组织、转录调控和DNA修复至关重要。突变分散在整个基因中，尽管大多数位于N末端和STAG结构域，并且通常是无义、移码或剪接位点突变。通过NGS识别MDS相关突变具有相关的临床意义，因为它可以识别高危AML患者亚组，这些患者可能受益于替代的一线治疗（例如，CPX-351）和随后的异基因造血干细胞移植 (allo-HSCT) 巩固。

RUNX1突变

RUNX1 突变在继发性AML中富集，ICC分类将该基因纳入AML伴MDS相关突变的定义型特征中。RUNX1 编码一个转录因子，是造血的关键调节因子，参与造血干细胞的出现和功能。突变谱主要包括N端区域的错义突变，特别是在RUNT结构域内，以及蛋白质C端部分反式激活域 (TAD) 内的截短突变。在所有髓系恶性肿瘤（包括AML）中，RUNX1 突变始终与不良预后相关。

AML定义性突变

CEBPA。 CEBPA 基因位于染色体19q13.11，编码对髓系分化至关重要的转录因子。5%至15%的AML病例携带CEBPA 突变，且在年轻成人中更常见。这些突变可能影响N端TAD和C端bZIP结构域，并且可以是单等位基因或双等位基因。ICC和WHO 2022分类都认可CEBPA 突变AML为一个独特的实体，但范围不同：ICC仅包括具有框内bZIP结构域突变的AML病例（允许较低的原始细胞计数≥10%）；而WHO定义了一个更广泛的伴CEBPA 突变的AML类别（包括双等位基因和bZIP单等位基因突变）。CEBPA 突变可以通过PCR检测，但NGS是一种有用的工具，能够识别突变数量（单等位 vs. 双等位）及其在N端和C端区域的位置。这种区分具有临床意义，因为大多数家族性CEBPA 突变位于N端部分，并且通常伴有C端结构域的"二次打击"。检测到VAF ≥ 30-40%的此类变异应提示进行胚系检测。一些研究也强调了NGS在检测双等位基因CEBPA 突变方面的挑战，部分原因是该基因的高GC含量。

NPM1。 核磷蛋白 (NPM1) 基因编码最丰富的核仁蛋白。通过其作为组蛋白伴侣的作用及其在细胞核和细胞质之间穿梭的能力，NPM1参与多个细胞过程，包括通过液-液相分离形成核仁、调节核糖体生物发生和运输、控制DNA修复和中心体复制，以及对核仁应激的反应。NPM1 是AML中最常突变的基因，发生在约30-35%的病例中。由于其独特的生物学和临床特征，NPM1 突变的AML在WHO第5版和ICC髓系肿瘤分类中均被确认为一个独特的实体。NPM1 的突变不典型地影响C端区域，导致其在白血病细胞中异常定位于细胞质。新药Menin抑制剂（例如revumenib）在复发/难治性AML中显示出活性。几项研究比较了通过PCR和NGS检测NPM1，突出了存在的差异。在实践中，PCR提供比NGS更快的周转时间和适用于MRD监测的高灵敏度。另一方面，NGS允许检测常见热点区域之外的罕见或非典型突变。

驱动靶向治疗的AML突变 (IDH1/2和FLT3)

在AML诊断时，FLT3 和IDH1 或IDH2 中的突变分别代表了适合和不适合强化疗 (IC) 患者的可操作（actionable）靶点。因此检测这些突变至关重要；PCR由于其快速的周转时间和较低的成本，仍然是金标准（例如，Abbott RealTime IDH1）。在临床上，当存在FLT3-ITD或FLT3-TKD时，可以在标准的7+3方案基础上加入米哚妥林（midostaurin），而奎扎替尼（quizartinib）则专门用于FLT3-ITD。类似地，在不适合IC的患者中，IDH1 阳性病例可以从在阿扎胞苷方案基础上添加艾伏尼布中获益。NGS显示出与PCR的良好一致性，尽管其对FLT3-ITD的灵敏度略低。

NGS对风险分层的影响

当血液科医生评估一名新的AML或MDS患者时，首要问题之一是"这种肿瘤的预后如何？"。基于年龄、合并症、老年评分、免疫系统状况、疾病的遗传特征和可用疗法的有效性等关键因素，已经开发了多种预后工具。早期的预后系统也依赖于细胞遗传学数据（例如，ELN2017），但最近的风险分层纳入了需要NGS检测的多种遗传改变。因此，在AML或MDS诊断时，NGS分析越来越必不可少。初始分层也可指导治疗决策，如allo-HSCT的指征。本节将重点讨论NGS结果对风险分层的影响。

MDS：分子数据的预后影响

MDS既代表诊断挑战，也代表分类挑战，主要是由于其遗传复杂性。体细胞突变正越来越多地被纳入现代WHO和ICC分类，同时通过整合最常改变的MDS基因的突变谱来改进传统风险分层工具的努力也在进行。MDS是一种异质性疾病，准确的生存预测对于治疗决策至关重要。传统上，IPSS-R是使用最广泛的风险工具，用于预测结局，它整合了血细胞减少、骨髓原始细胞百分比和细胞遗传学异常。IPSS-R已得到广泛验证，然而疾病的演变可能有很大差异，取决于疾病相关和患者相关因素。近年来MDS遗传特征的理解已经扩展，多项研究考察了体细胞突变对患者预后的影响。基于对3711名MDS患者的152个基因突变谱分析，IPSS-M是最近开发的一个风险分层评分，它将分子信息与传统参数（包括血细胞减少、骨髓原始细胞百分比和细胞遗传学）相结合。MDS患者根据31个通常包含在常规NGS髓系panel中的基因的突变状态被分为六类，这些基因分为16个主要效应基因和15个次要基因。多打击TP53、FLT3-ITD/TKD 和 KMT2A-PTD 在预测不良结局方面特别有影响力。有趣的是，46%的MDS患者根据IPSS-M进行了重新分类，与原始IPSS-R类别相比，其中大多数被分配到更高风险组。IPSS-M已在大型患者队列中验证了其预后准确性；然而关于这种重新分类应如何指导治疗决策的数据仍然有限。

在这些队列中，20%的根据IPSS-R分类为低危的患者被IPSS-M提升为中危，25%的根据IPSS-R为中危的患者被IPSS-M重新分类到更高风险组。值得注意的是，类似比例的IPSS-R中危患者在IPSS-M下被降级为低危。然而，在临床实践中，重新分层并不一定意味着所有受影响的MDS患者都会发生重大的治疗变化。Zamanillo等人最近的分析表明，IPSS-M重新分类可能会影响22.2%患者的治疗决策：17%将成为治疗强化的候选者，5%将成为治疗降级的候选者。然而，当考虑年龄和体能状态时，只有6.6%的总队列患者实际上有资格接受更高强度的治疗。在HSCT背景下，Tentori及其同事报告称，基于IPSS-M的策略有利于对<70岁且为低或中低危的患者延迟移植，而对中高危、高危或极高危的患者，立即移植改善了预期寿命。他们的研究结果表明，15%的根据IPSS-R最初考虑立即进行HSCT的患者在IPSS-M下将从延迟HSCT中受益，而19%的根据IPSS-R最初被分配到延迟策略的患者在根据IPSS-M重新评估时，反而会从立即HSCT中受益。总体而言，与基于IPSS-R的政策相比，基于IPSS-M的政策产生了显著的预期寿命增益 (p=0.001)。目前仍缺乏使用IPSS-M的前瞻性临床试验，从而限制了其在系统性MDS风险分层中的广泛应用。尽管如此，整合到IPSS-M中的分子信息可能有助于治疗决策，特别是对于适合移植的较年轻患者 (<70岁)。考虑到整个MDS人群，基于IPSS-M会经历有意义的治疗改变的患者比例仍然相对较小，在老年人中不到10%，在较年轻个体中不到19%。对于这些患者，分子发现必须纳入全面的临床评估，包括体能状态、移植资格、HLA匹配和供者相关因素。

AML

自2010版以来，ELN AML风险分层的建议不断演变，逐步包含了关于基因突变预后影响的越来越多的证据。与2010和2017版相比，最新的2022更新需要对13个基因进行突变分析，以准确地将AML患者分配到低危、中危或高危类别。特别是，高危组已扩展至包括七个额外的突变：BCOR、EZH2、SF3B1、SRSF2、STAG2、U2AF1 和ZRSR2——与ASXL1 和RUNX1（已包含在ELN 2017中）一起，形成了"骨髓增生异常相关" (MR) 基因群。因此，NGS的使用已成为AML正确和准确风险分层的关键。

存在这些突变中的任何一个都将患者分配到高危类别，除非伴有低危改变；TP53 突变在ELN2022中特别强调。多项研究验证了ELN2022指南，并进一步探讨了MR突变的作用。大多数研究强调了具有不同MR突变的患者之间结局的显著异质性：例如，RUNX1、ASXL1 和U2AF1 通常与更差的结局相关，而EZH2、STAG2 和ZRSR2 往往显示中等风险结局。不断演变的AML治疗格局导致了针对老年或不适合AML患者的低强度方案的发展。去甲基化药物 (HMA；阿扎胞苷和地西他滨)以及基于HMA的联合方案（联合维奈克拉或在IDH1 突变AML中联合艾伏尼布）改善了这些患者类别的结局。然而，先前的风险分层，包括ELN 2022，是基于强化治疗患者的临床试验，试图将这种分类应用于低强度方案并不尽如人意。

接受低强度治疗的AML患者分层

2024年，ELN为接受基于HMA的低强度方案治疗的新诊断AML患者提出了基于遗传学的风险分类 (2024 ELN Low-Intensity)。该分类源自大型试验队列，包括随机分配guadecitabine或其他疗法（guadecitabine vs. 阿扎胞苷、地西他滨或小剂量阿糖胞苷[LDAC]）的ASTRAL-1试验、VIALE-A试验 (NCT02993523) 随机分配阿扎胞苷和维奈克拉联合治疗与阿扎胞苷和安慰剂，以及AGILE 3期研究 (NCT03173248) 将IDH1 抑制剂艾伏尼布添加到阿扎胞苷（与阿扎胞苷-安慰剂比较）。核型状态加上一小组基因，包括NPM1、IDH1/2、FLT3-ITD、DDX41、NRAS、KRAS 和TP53，足以将患者分为低危、中危和高危类别。在ELN 2024中，中危组仍然相当广泛，因为许多细胞遗传学和分子异常在低强度AML治疗背景下缺乏可靠的预后数据。此外，继IDH1 突变之后（在引入特异性抑制剂后现被认为是有利的），随着新的靶向治疗的出现，其他基因突变可能会被重新分类。

NGS在MRD测量和监测中的作用

可测量残留病 (MRD) 在AML患者中已变得越来越重要，用于指导治疗——例如选择最佳巩固策略、维持治疗、随访或供者淋巴细胞输注 (DLI)，用于监测复发，并作为预后生物标志物。

欧洲白血病网MRD工作组2021年关于AML中MRD的更新认为，除了多参数流式细胞术 (MFC) 外，基于NGS的MRD监测对于细化预后也是有用的，然而目前的证据不足以推荐NGS-MRD作为独立技术。主要的缺陷在于NGS方法检测极小的MRD克隆的灵敏度相对较低。在诊断时，如果VAF>5%，则变异被认为是显著的；而基于基因组DNA测量的NGS-MRD阳性被暂时定义为≥0.1% VAF。尽管NGS-MRD检测阴性定义为VAF<0.1%，但即使低于此阈值的结果仍可能与不良预后相关。

NGS-MRD的优势在于其可检测克隆异质性，以及在AML复发之前检测突变的获得的或丢失。例如，NPM1 突变通常被认为是qRT-PCR监测的稳定标志物，但在约10%的患者中，复发时可能变得不可检测。因此，分析更广泛的基因panel可以更好地监测AML中的克隆演变，并识别可预测即将发生形态学复发的、正在出现的突变。尽管如此，NGS-MRD也有其局限性，包括在没有错误校正方法的情况下灵敏度低，以及检测在健康个体中可能由于年龄相关的克隆性造血而发生的突变——特别是DNMT3A、TET2 和ASXL1 (DTA基因)。胚系突变（通常显示VAF约为50%）对于MRD无信息价值。其他局限性包括遗传克隆异质性和随时间推移的演变，以及复发时亚克隆的出现或选择。在MORPHO试验的事后分析中，用NGS测量的MRD水平与无复发生存期 (RFS) 和复发风险显著相关；此外，任何水平的MRD阳性都对RFS产生负面影响。

尽管基于NGS的MRD评估具有潜力，但它仍然是一种研究性的、非标准化的技术，甚至最佳的检测时间点仍存在争议，并且在存在室间差异。然而也有两个值得注意的例外，即FLT3 MRD和一个五基因NGS panel正接近整合到临床实践中。

编码FMS样酪氨酸激酶-3 (FLT3) 的基因是AML中最常突变的基因之一，在大约25%的病例中发生改变。FLT3 突变最常见的是内部串联重复 (ITDs)，其长度可以从少至三个碱基对 (bp) 到超过400 bp不等，但通常保持在框内，因此产生功能蛋白质。每个FLT3 突变患者都有独特的ITD序列，这使得使用基于PCR的MRD检测进行纵向监测在技术上具有挑战性。Invivoscribe® 开发并获得FDA批准的一项先进的实验室技术值得注意，该方法结合了最初的PCR（旨在扩增FLT3-ITD突变）和随后的NGS，使用带条形码的引物来靶向FLT3 基因近膜 (JM) 结构域周围的区域（ITD通常在此处发生），以选择性扩增感兴趣的序列。然后纯化所得的PCR产物并进行NGS分析准备，从而实现ITD变异的灵敏检测和定量。该检测能够检测范围从9 bp到252 bp的ITD，以及从3 bp到最大可检测ITD大小的插入，分析灵敏度为每总等位基因5×10⁻⁵突变等位基因。MORPHO试验有力地证明了这种组合PCR/NGS方法用于FLT3 MRD评估的临床实用性。在该研究中，患者在allo-HSCT后接受吉瑞替尼治疗2年。大约半数参与者在移植前或移植后具有可测量的MRD。在预设的亚组分析中，吉瑞替尼显著改善了MRD阳性患者的结局（HR, 0.515 [95% CI, 0.316 to 0.838]; p=0.0065），但在检测不到MRD的患者未达到。预计这种用于FLT3 检测的NGS/PCR方法很可能纳入未来的MRD检测指南。

基于NGS的MRD的最新报道是pre-MEASURE研究，该研究评估了五基因panel在AML患者中的预后价值。在移植前血液样本上进行靶向错误校正DNA测序，以检测FLT3、NPM1、IDH1、IDH2 和KIT 中的变异。血液中FLT3-ITD或NPM1 变异以0.01%或更高的等位基因分数持续存在与复发率增加和更差的生存期相关（相对于缺乏这些变异的患者）。此外，在ALFA0702研究 (NCT00932412) 中，基于错误校正NGS的MRD评估表明，在多变量分析中，非 DTA 突变（RFS的HR = 2.23，OS的HR = 2.26）和 DTA 突变（OS的HR = 2.16）的持续存在与预后较差相关。

NGS在检测胚系易感性中的作用

当接诊一名新诊断的AML患者时，现在，仅通过执行标准诊断性NGS panel就可以检测胚系易感性。在一个韩国AML患者队列中，胚系突变的患病率为7.2%。当VAF相对较高时（通常≥30-40%），就可怀疑突变是胚系起源的，而非后天获得的体细胞突变。因此，NGS已经彻底改变了"家族性MDS/AML"的传统临床概念，该概念先前定义为在同一家族中至少有两个或更多一级和/或二级亲属发生急性白血病、髓系恶性肿瘤或特征性血细胞减少，且至少有一例被诊断为MDS或AML。与之相反，在进行诊断性NGS时，临床医生应该意识到，并在事前告知患者，在AML/MDS诊断时进行检测可能会发现胚系突变，或可揭示家族易感性。这样的发现可能给患者及其亲属带来重大的临床、心理和社会影响。此外，存在赋予家族易感性的胚系突变可能会影响在考虑来自亲属的allo-HSCT)时供者来源的选择。尽管供者来源的白血病较为罕见事件（约1%），但已有MDS来自供者细胞的病例报告描述。ELN-2022指南概述了应提示进行胚系易感性检测的临床特征，包括至少两种癌症、在异常年轻时诊断的AML/MDS、伴有在50岁前患有血液癌症或实体瘤的一级或二级亲属（在两代以内）的血液恶性肿瘤个人史，或存在其他造血异常。相反，北欧MDS研究组 (NMDSG) 提出了略有不同的标准，用于识别应评估髓系肿瘤伴胚系易感性的患者。他们还建议，对通过诊断性NGS检测到的任何致病性变异，应在不同的组织（例如成纤维细胞或在缓解期采集的外周血）上进行确认。

WHO血液淋巴肿瘤分类第5版将髓系肿瘤伴胚系易感性分为三个亚组：髓系肿瘤伴胚系易感性，无预先存在的血小板障碍或器官功能障碍 ( DDX41、TP53、CEBPA )；髓系肿瘤伴胚系易感性和预先存在的血小板障碍 (RUNX1、ANKRD26、ETV6 )；以及髓系肿瘤伴胚系易感性和潜在器官功能障碍 (GATA2、Shwachman-Diamond综合征[SDS]、范可尼贫血[FA]、唐氏综合征等)。

DDX41

与胚系髓系肿瘤相关的最常见的遗传改变是DDX41，约占病例的80%。DEAD-box解旋酶41 (DDX41)位于染色体5q35，在先天免疫感应和造血稳态中发挥重要作用。DDX41 可识别微生物感染期间产生的外源或自身来源的核酸，从而启动抗病原体反应。在涉及9082名髓系肿瘤 (MN) 患者中346名DDX41 患者的最大规模国际研究中，DDX41 占MN胚系易感性的80%。值得注意的是，在日本男性人群中，DDX41 突变的发生率比普通人群高10倍。此外，携带DDX41 突变的个体在40岁左右之前患AML/MDS的风险较低，但到90岁时增加到约50%。此外，根据ELN2024，当AML用HMA+维奈克拉治疗时，DDX41 突变似乎与良好预后相关；然而这一观察是基于有限数量的患者，使得这些发现尚不成熟。类似地，在接受强化疗的患者中，MDS/AML中存在突变的DDX41 能带来良好预后，与DDX41 野生型AML和其他有利风险AML病例相比总生存期 (OS) 更长。DDX41 的保护作用似乎减轻了其他不良标志物（如TP53）的负面影响。北欧胚系易感性髓系肿瘤工作组的建议包括对有症状的胚系DDX41 变异携带者进行监测的指导。

TP53

TP53基因编码一种被认为是细胞最关键转录因子之一的蛋白质，通常被称为"基因组守护者"。由于其关键功能，TP53 是人类癌症中最常发生突变的抑癌基因。Li-Fraumeni综合征是由TP53 的致病性胚系突变引起的，与各种实体瘤（如乳腺、胰腺、中枢神经系统肿瘤和肉瘤）以及血液恶性肿瘤（如MDS、AML和ALL）的风险显著增加相关。到70岁时，受影响个体患癌症的可能性几乎达到100%。在这些患者中，髓系血液恶性肿瘤通常继发于先前因其他癌症而接受的放疗或化疗治疗。TP53 的突变大大增加了与这些血液癌症相关的风险，并且始终与不良预后相关。

GATA2

GATA结合蛋白2 (GATA2) 在血干细胞生成和维持中起核心作用，并通过调节MDM2调节因子RASSF4直接调节p53诱导的细胞凋亡，可能有助于化疗耐药。GATA2综合征于2011年首次在表现为单核细胞减少症、B细胞、B细胞前体和NK细胞缺陷，和/或血液中浆细胞样树突状细胞缺失；迟发性感染（非结核分枝杆菌、真菌或人乳头瘤病毒 (HPV) 感染）；肺肺泡蛋白沉积症；进展为MDS或AML风险增加；以及由于GATA2 单倍体不足突变导致的常染色体显性遗传模式的患者中被描述。胚系GATA2 突变约占儿童晚期和所有原发性MDS病例的15%和7%，使GATA2 成为最常见的儿童胚系突变。尽管关于allo-HSCT疗效的数据仅限于体细胞GATA2 突变AML患者的小型队列，但移植似乎有益，也降低机会性感染的风险。考虑到已经描述了近200种可能独特的致病性变异，可将其分为四组：(1) ZF2结构域内或附近的截短突变（剪接位点、无义、移码和全基因缺失）；(2) ZF2结构域内的错义突变；(3) 导致异常mRNA剪接的突变（例如，同义改变）； (4) 其他调节性变异，对整个基因进行NGS研究以检测所有可能的致病性变异至关重要。

RUNX1

RUNX1 基因编码一个关键的造血转录因子，最初在携带 t(8;21) 易位的AML病例中被发现。其最初被命名为AML1，后来因其与果蝇转录因子runt 的同源性而更名为RUNX1，形成了"Runx"转录因子家族。1999年，RUNX1 胚系突变被与家族性血小板疾病伴相关髓系恶性肿瘤联系起来，这是一种罕见的常染色体显性疾病，其特征为血小板减少和对髓系肿瘤易感。在一项对27个有RUNX1 变异的家族的研究中，一半的受影响个体有CHIP，来自19名患者的连续测序数据显示了体细胞突变随时间的动态变化。伴RUNX1 突变的AML患者预后不良。由于已经描述了RUNX1 的多种改变，包括多外显子或全基因缺失、移码、错义和无义突变，NGS对于全面检测它们至关重要。此外，与其他与血小板减少相关的家族性疾病的鉴别诊断需要对ETV6和ANKRD26进行测序。

ETV6

ETV6 基因产生属于ETS家族的转录抑制因子，在红细胞和巨核细胞成熟中起关键作用。胚系ETV6 突变以常染色体显性方式遗传，可导致5型血小板减少症，并伴有约30%的发展为血液癌症的风险。这些恶性肿瘤可以是淋巴样（如急性淋巴细胞白血病，ALL）或髓样（包括AML）。与其他遗传性血液疾病类似，癌症的发生通常需要获得至少一个额外的体细胞突变，这些突变通常与白血病发展有关。

NGS在复发时检测可靶向突变

在接受多线治疗或异基因移植后复发的AML患者中，预后极差，因此有必要在可行时启动早期姑息治疗或将患者纳入临床试验。然而在不久的将来，NGS可能成为指导靶向复发/难治性AML患者中检测到的可操作基因的指南针。一份意大利病例报告展示了两名患者在疾病进展过程中的克隆和亚克隆演变，突显了NGS如何帮助发现新的治疗靶点。在一个包含1470名AML患者的更稳健的数据集中，使用NGS分析了17个可能有操作空间的基因（ALK、CSF1R、FGFR1/2/3、FLT3、IDH1/2、JAK2、KDR、KRAS/NRAS、NPM1、PDGFRA、PTPN11、RET 和TP53），因为这些基因可以直接或间接受标准治疗（6%的患者接受了超适应症用药）或研究性药物（这些患者中有53%参加了临床试验）靶向。这种方法的主要缺陷在于，通过NGS识别的许多突变要么与尚未批准的药物相关，要么目前无法用现有治疗方法靶向（例如，TP53）。尽管如此，NGS仍有望改善老年人的生存和生活质量。

讨论

更快、更便宜的NGS技术的出现有望彻底改变MN领域，目前有几种可用的基因panel（例如，Illumina TruSight Myeloid panel、Archer VariantPlex Core Myeloid panel、QIAGEN Human Myeloid Neoplasms QIASeq DNA Panel 和 AmpliSeq for Illumina Myeloid panel）。可以使用基于RNA的NGS（RNA测序）的单一诊断检测来检测几种易位，从而降低成本并保护实验室资源免于广泛的细胞遗传学分析和针对选定转录本的多个特异性实时定量PCR。通过对已知基因伴侣进行RNA测序，发现其他罕见伴侣变得更容易（例如，KMT2A）。此外，对测序技术有困难的较长基因进行测序的可能性（例如，CEBPA 是一个富含GC的基因，特别难以通过PCR扩增，或TP53）可以帮助临床医生将患者分配到更合适的风险组。尽管如此，我们在一线治疗中仍然只有有限数量的药物，减少了为每位患者提供个性化治疗和精准医学的可能性。在一项回顾性研究中，根据新获得的NGS和细胞遗传学数据对患者进行了重新评估；然而，两组之间的生存期没有发现统计学上的显著差异。

对于MDS或AML患者，TP53 突变可能代表着最负面的预后标志物之一，因为它们与化疗（包括基于维奈克拉的治疗）敏感性低相关，并且在HSCT后的反应也显著更差。因此，对TP53 进行测序至关重要，尽管技术挑战仍然存在（例如存在尚未被当前数据库完全覆盖的意义未明变异）。不幸的是，迄今为止还没有基于p53的治疗药物上市，可能是因为作为一种核转录因子，p53不具有典型的药物靶点特征，因此长期以来一直被认为是不可成药的。另一个热门话题是使用NGS作为MRD标志物，这有助于细化选择首次完全缓解期的AML患者进行移植，并指导移植后维持治疗（例如，MRD阳性患者使用吉瑞替尼）的决策。此外，复发的患者通常表现出克隆演变和生物学变化，使治疗复杂化，但NGS提供了一个机会来研究对靶向药物（如FLT3抑制剂）耐药的具体机制。未来，个性化医学可以应用于通过NGS快速识别的患者；例如，Menin抑制剂用于KMT2A 重排的AML。

结论

阅读AML或MDS患者NGS检查的最终报告是一项具有挑战性的任务，临床医生应了解其实验室采用技术的潜力和局限性，包括使用的平台、测序深度以及已识别变异的解读。VAF是另一个关键参数，特别是在携带克隆性造血典型突变（例如，DNMT3A、SRSF2、TET2）的患者中应考虑，因为它反映了诊断时和随访期间克隆的大小。另一个重要的概念是，并非同一基因中的所有突变都是等效的，一些病例仍然具有未知的临床意义 (VUS)。这些变异需要查阅专门的数据库，这些数据库可能提供有限的信息，并且随着时间的推移可能会发生变化，因为当新证据出现时，一些VUS可能会被重新分类。目前临床医生在日常实践中正驾驭着日益复杂的分子数据，因此鼓励与参与NGS分析和报告准备的生物技术学家和生物信息学家直接互动。此外，对于疑似MN胚系易感的患者，建议进行遗传咨询和多基因panel检测。总之，血液科医生和生物技术学家之间关于NGS报告的对话不应被视为终点，而应被视为多学科讨论的开始，特别是在最具挑战性的病例中。

未来方向

AML和MDS领域的NGS正在快速变化，更快、更简单、更经济的测序平台的可用性日益增加。临床医生在解读患者NGS报告方面正在积累经验和信心。相信这将深刻地影响临床实践，因为NGS可能会为每位患者进行，包括老年人。该领域的复杂性乍一看可能令人不知所措，包括需要查阅基于网站的病理性变异数据库。尽管如此，人工智能算法的整合可以简化血液科医生的任务，并有助于避免分析瘫痪。

参考文献

Perrone S, Tresoldi C, Rigamonti S, Molica M, Zhdanovskaya N, Cicconi L. How to Read a Next-Generation Sequencing Report for AML and MDS? What Hematologists Need to Know. J Clin Med. 2025 Dec 8;14(24):8681. doi: 10.3390/jcm14248681. PMID: 41464583; PMCID: PMC12733557.