Tisa-cel与axi-cel的CAR结构差异影响CD19-CAR-T治疗耐药性的发生

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CD19-CAR-T细胞疗法是复发/难治性B细胞恶性肿瘤的重要治疗手段，但约50%的患者在输注后复发。临床数据显示，tisa-cel（4-1BB共刺激域） 治疗后CD19突变率较高，而axi-cel（CD28共刺激域） 则较低，但缺乏直接比较。此外，两种产品均靶向FMC63表位，但铰链区/跨膜区/共刺激域结构不同：Tisa-cel为CD8α铰链 / CD8α跨膜 / 4-1BB共刺激，Axi-cel为CD28铰链 / CD28跨膜 / CD28共刺激。那么问题来了，CAR结构本身是否是导致CD19抗原丢失和耐药发展的关键决定因素？

因此学者开展研究，直接比较了基于4-1BB的tisa-cel和基于CD28的axi-cel的CAR结构，以探究CAR结构在两种不同B细胞恶性肿瘤模型中CD19-CAR-T细胞治疗耐药性发展中的作用。

研究方法

体外模型

使用Burkitt淋巴瘤细胞系（Raji）和B-ALL细胞系（Nalm-6）

将肿瘤细胞与CD19-4-1BB-CAR-T细胞或CD19-CD28-CAR-T细胞共培养19个连续传代（模拟临床反复暴露）

评估：流式细胞术（FMC63表位、总CD19）、Western blot、RT-qPCR、RNAseq、全外显子/靶向测序

患者队列

18例tisa-cel治疗的儿童B-ALL患者（2019-2025年，La Paz医院）

同时汇总文献中89例接受4-1BB或CD28 CAR-T治疗患者的NGS数据

数学模拟

构建包含耐药细胞、低抗原细胞、高抗原细胞三种亚群的肿瘤群体模型

模拟19次迭代中两种CAR-T对不同抗原密度肿瘤细胞的清除效率

研究结果

临床患者数据

18例tisa-cel治疗患者中，5例（28%）复发（1例原发耐药，4例CR后复发）

复发的4例中：2例CD19阳性，2例CD19阴性（占复发的40%）

CD19阴性患者NGS检出CD19外显子2-3的移码或提前终止突变

文献汇总（89例）：4-1BB CAR-T治疗后CD19突变率26%，CD28 CAR-T治疗后仅5%

体外耐药模型

19次暴露后：

• CD19-4-1BB-CAR-T处理组：Raji和Nalm-6均完全耐药（对CAR-T杀伤无反应）

• CD19-CD28-CAR-T处理组：未诱导完全耐药，细胞仍保持一定敏感性

CD19抗原丢失机制

基因层面改变

CD19-4-1BB CAR-T处理组（唯一检出CD19基因突变）：

Raji-CAR-4-1BB：

• 外显子3单碱基缺失 → 移码突变（p.L156Cfs*25），VAF=95%

• 同时伴有杂合性缺失（LOH）（CD19及邻近基因NFATC2IP、SPNS1均变为纯合）

• 导致CD19蛋白完全丢失

Nalm-6-CAR-4-1BB：

• 两个突变存在于同一克隆的不同等位基因（反式构型）：移码突变 p.S103Lfs*27（外显子2，VAF≈30%）；错义突变 p.R163H（外显子3，VAF≈55%）

• R163是FMC63表位的关键残基，突变后FMC63无法结合

• 克隆演化：p14开始出现突变（VAF>2%），p16 FMC63阴性群体占主导

CD19-CD28 CAR-T处理组：

• 无任何CD19基因突变

• CD19下调可能通过表观遗传或其他调控机制，非基因突变

异常剪接

RNAseq显示：CD19-4-1BB处理组（非CD28组）中内含子2和内含子6保留显著增加

内含子保留可导致提前终止密码子 → 截短蛋白或无功能CD19

此现象与临床tisa-cel复发患者一致

数学模拟

关键参数设定：CD28 CAR-T对低抗原细胞的杀伤效率是4-1BB CAR-T的5倍

模拟结果：

•  4-1BB CAR-T无法有效清除CD19^低表达细胞 → 低抗原细胞扩增 → 第9代出现 → 第17代耐药细胞可检测 → 第19代完全耐药

• CD28 CAR-T维持低/高抗原细胞比例稳定 → 19代内不产生耐药细胞

结论：4-1BB CAR-T对低抗原细胞的杀伤不足是耐药克隆扩增的驱动因素

诊断陷阱

使用不同CD19抗体克隆检测耐药细胞：

• FMC63（CAR靶向表位）：在Nalm-6-CAR-4-1BB中完全阴性

• HIB19、SJ25C1、J3-119（常用IVD流式抗体）：仍为阳性

• LE克隆（常用IHC抗体，针对胞内表位）：仍为阳性

关键警示：常规诊断用抗CD19抗体（非FMC63）可能给出假阳性CD19结果，掩盖真正的FMC63表位丢失

建议：CAR-T治疗后复查应使用FMC63特异性检测，而非普通CD19诊断试剂盒

总结

CAR结构是CD19抗原丢失的关键决定因素：4-1BB CAR（tisa-cel）驱动CD19基因突变和表位丢失，而CD28 CAR（axi-cel）不诱导基因突变

机制差异：

•  4-1BB CAR对CD19低表达肿瘤细胞清除能力不足 → 低抗原细胞扩增 → 为CD19基因突变的出现提供“土壤” → 双等位基因失活 → 完全耐药

• CD28 CAR能有效清除低抗原细胞 → 耐药克隆无法扩增

临床意义：

• 解释了为何tisa-cel治疗后CD19阴性复发率高于axi-cel

•  优化CAR设计以提高对低抗原密度细胞的识别能力，可能预防耐药克隆出现、降低复发率

诊断建议：

• 目前IVD抗CD19抗体（HIB19、SJ25C1、LE等）识别的表位不同于FMC63

• CAR-T治疗后评估CD19状态，应使用FMC63特异性试剂，避免假阳性误导临床决策

参考文献

Krawczyk, M., Fidyt, K., Fernandez-Fuentes, N. et al. Tisa-cel and axi-cel CAR structure influences the development of resistance to CD19-CAR-T therapy. Leukemia (2026). https://doi.org/10.1038/s41375-026-03081-3