吉林大学Biomaterials：质子门控金纳米簇平台通过破坏生物膜生物能量学与抑制毒力用于细菌感染治疗

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背景介绍

牙周炎是一种由菌群失调生物膜驱动的慢性炎症性疾病，全球约10%的成年人受其晚期表现影响，导致不可逆的牙齿丧失和全身健康风险。牙龈卟啉单胞菌作为“基石病原体”，通过形成弹性生物膜和经IX型分泌系统分泌毒力因子（如牙龈蛋白酶）重塑微生物群落并放大宿主破坏性反应。然而，牙周生物膜的结构韧性、空间异质性和生理适应性使得传统抗菌策略难以彻底清除持续或复发性生物膜相关感染。因此，亟需能够将细菌清除与T9SS相关毒力衰减相结合的创新策略，超越广谱杀菌方法的局限。

研究思路

针对上述挑战，吉林大学孙晓琳、王琳教授、白雪教授、武振楠教授与新加坡国立大学谢建平教授团队开发了AHMP稳定的超小金纳米簇（AHMP@AuNCs，<2 nm），基于以生物能量学为中心的“代谢陷阱”范式发挥抗菌作用。AHMP配体提供三重协同功能：嘧啶模拟配体壳促进细菌积累（可能通过嘧啶相关识别或摄取途径）；Au-配体界面发生可逆的pH依赖性电子态调制——近中性至弱碱性条件下有利于电荷转移相关界面态的形成；亚2 nm尺寸支持生物膜穿透和膜相关生物能量学过程的接触。细菌积累后，AHMP@AuNCs破坏质子稳态和能量偶联，导致ATP和NAD耗竭、核苷酸代谢失衡、继发性氧化应激以及T9SS依赖性毒力抑制。整合代谢组学和转录组学分析揭示了能量、核苷酸和毒力网络的协同重编程。在口腔生物膜模型中，AHMP@AuNCs抑制生物膜形成并进入成熟生物膜内部区域，在评估的宿主细胞模型中表现出有限的细胞毒性。在实验性牙周炎中，局部给药保留了上皮屏障完整性、减轻炎症、降低牙龈卟啉单胞菌相关负荷并限制牙周组织破坏。相关内容以 "A proton-gated gold nanocluster platform for disrupting biofilm bioenergetics and suppressing virulence in bacterial infections" 发表在 《Biomaterials》！

图片解析

图1. pH响应性Au-配体界面支持质子依赖性配位调制： (a) AHMP配体分子设计。(b) TEM显示AHMP@AuNCs均匀分散，平均粒径1.68±0.45 nm。(c) UV-Vis吸收显示与游离AHMP相比红移。(d) FTIR显示硫醇峰消失，证实Au-S键形成。(e) pH依赖性FTIR显示1415和1450 cm⁻¹处峰在pH 7-8清晰可辨，pH 6时合并为宽峰。(f) pH依赖性拉曼显示210 cm⁻¹处Au-S-C弯曲峰保持完整，300-340 cm⁻¹处硫桥区域在酸性条件下分裂。(g) N 1s XPS显示弱碱性条件下嘧啶N组分贡献增加，酸性条件下氨基/质子化N组分增加。(h) Au 4f XPS显示弱碱性条件下Au(I)相关贡献增加。(i) 提出的pH依赖性界面配位模型示意图。

图2. 质子化依赖性电子态调制和质子参与电荷转移行为： (a) pH依赖性UV-Vis显示255 nm特征峰随pH降低红移宽化。(b) 发射光谱分解为PL1（~620-630 nm）和PL2（~690-700 nm）组分，pH从8降至6时PL1贡献从48.76%增至62.63%。(c) 激发-发射图谱可视化pH依赖性演变。(d) 动力学同位素效应显示弱碱性条件下KIE≥1.5，pH 6时降至1.0-1.2。(e-f) 超快瞬态吸收显示pH 6时单调衰减，pH 7-8时630 nm处出现延迟特征（~45-49 ps）。(g) 循环伏安显示峰电位随pH增加系统负移（~-34 mV pH⁻¹）。(h) 质子化依赖性界面电荷转移调制示意图。

图3. 胞内AHMP@AuNCs破坏细菌质子稳态和生物能量偶联： (a) TEM-EDS显示AHMP@AuNCs Au信号延伸至细菌内部与N信号重叠，AHMP@AuNPs Au信号主要位于细胞表面。(b) EDS线扫证实AHMP@AuNCs胞内Au信号持续存在。(c) TEM显示AHMP@AuNCs处理后包膜不规则、周质空间扩张、胞质清亮。(d-f) BCECF-AM、DiSC3(5)和CTC显示AHMP@AuNCs快速降低胞内pH（<6.5）、去极化膜电位、抑制呼吸电子传递。(g) ATP从3.37降至2.56 μM mg⁻¹（P<0.0001）。(h) 24 h后BCECF和CTC显示胞内pH持续降低、呼吸活性持续抑制。(i) 流式DiSC3(5)证实持续膜去极化。(j) AHMP@AuNCs相关红色荧光位于HOECs边界内。(k) ICP-MS显示P. gingivalis中Au含量（37.5 mg kg⁻¹）为HOECs（0.17 mg kg⁻¹）的200倍以上。(l) MitoTracker显示HOECs线粒体形态无明显改变。(m) 优先细菌积累和生物能量破坏机制示意图。

图4. AHMP@AuNCs抑制生物膜形成并瓦解已建立的口腔生物膜： (a-b) CFU计数显示预防模型中P. gingivalis和F. nucleatum减少4.06-4.07 log，成熟生物膜中减少3.01-4.07 log。(c-d) SEM显示预防模型中细菌粘附和微菌落减少，破坏模型中生物膜结构明显恶化。(e-f) 活/死染色显示两种模型中均出现从活菌向死菌的显著转变。(g-i) AFM显示预防模型中P. gingivalis生物膜高度降低、粗糙度从47.47降至19.60 nm。(j) CLSM z-stack显示AHMP@AuNCs相关红色荧光分布在成熟生物膜内部多个光学切片中。(k) AFM显示破坏模型中不规则生物膜形态和细菌碎片。(l) 双相抗生物膜机制示意图。

图5. AHMP@AuNCs诱导生物能量崩溃的代谢组学和转录组学特征： (a) OPLS-DA显示处理组与对照组显著分离。(b) 火山图显示16个显著改变的代谢物。(c) 通路富集分析显示嘌呤/嘧啶生物合成显著扰动。(d) 热图显示核苷酸前体库协同减少。(e-f) QEA和ORA显示乙酰基转移和线粒体呼吸电子传递通路改变。(g) 差异表达基因火山图（252个显著改变）。(h) 上调基因GO富集显示膜转运相关过程。(i) GSEA显示核苷酸糖生物合成通路下调。(j) 下调基因GO富集显示氧化磷酸化和呼吸电子传递链抑制。(k-l) GSEA显示蛋白输出和细胞壁组织通路下调。

图6. 能量代谢与抗氧化防御的分子解偶联导致细菌死亡： (a) 热图显示NAD相关基因上调、ATP和T9SS相关基因下调。(b) 相关性分析显示NAD相关与ATP/T9SS相关基因表达强负相关（r<-0.8）。(c-e) RT-qPCR验证代表性NAD、ATP和T9SS基因表达模式。(f) 整合通路富集分析。(g) 抗氧化相关代谢物QEA。(h) ATP与L-半胱氨酸水平强正相关（r=0.83）。(i) 基因-代谢物网络分析。(j) DCFH-DA显示胞内ROS在30分钟内急剧上升（P<0.0001）。(k) “代谢陷阱”机制示意图：嘧啶模拟积累→NAD失调→ATP耗竭→继发性ROS积累→T9SS抑制。

图7. 牙龈蛋白酶相关毒力抑制保留上皮屏障完整性： (a-b) Rgp和Kgp活性在培养上清中降至对照的10-13%。(c-d) RT-qPCR显示rgpA、rgpB、kgp mRNA降低>55%。(e-f) 成熟生物膜中Rgp和Kgp荧光信号在1天和3天均显著降低。(g-i) ZO-1和Occludin免疫荧光显示AHMP@AuNCs处理组保持连续荧光模式，与空白对照组无统计学差异。(j-k) RT-qPCR证实TJP1和OCLN mRNA水平升高。(l-m) TEER测量显示AHMP@AuNCs在0.4 μm（限制细菌通过）和3 μm（允许细菌通过）系统中均保留屏障功能。(n-o) 大鼠牙周炎模型中AHMP@AuNCs处理组保持相对连续的上皮连接结构。

图8. AHMP@AuNCs的体内安全性和实验性牙周炎疗效： (a) 实验时间线。(b) RT-qPCR显示AHMP@AuNCs处理显著降低P. gingivalis 16S rRNA相关负荷。(c) H&E显示炎症细胞浸润减少、牙槽骨形态改善。(d) Masson染色显示胶原降解从63.23%降至18.41%。(e) Micro-CT显示AHMP@AuNCs保留牙槽骨量。(f) CEJ-ABC距离从0.84改善至0.46 mm（P<0.001）。(g-j) 近中、远中、颊侧和舌侧骨吸收均减少。(k-m) 免疫荧光显示TNF-α和IL-6表达降低。

结论

本研究证实了以生物能量学为中心的“代谢陷阱”策略用于抗菌和抗毒力治疗。超小AHMP@AuNCs相对于所评估的宿主细胞优先积累于细菌中，其质子响应性Au-配体界面经历可逆的配位和电子态调制，伴随质子参与的电荷转移行为。细菌积累后，AHMP@AuNCs破坏质子稳态和PMF依赖性能量偶联，导致NAD相关失调、ATP耗竭和广泛的代谢重组。整合代谢组学和转录组学分析进一步显示这些扰动扩展到核苷酸代谢、抗氧化防御和T9SS相关毒力通路，从而削弱细菌存活和致病性。这种协调反应抑制牙龈蛋白酶相关毒力并保护上皮屏障完整性，同时在测试条件下表现出良好的宿主细胞相容性和短期体内耐受性。通过将抗菌干预从以表面为导向的损伤转向胞内生物能量破坏，该工作为开发整合生物膜控制与毒力衰减的抗菌纳米治疗提供了框架。