南开大学ACS Nano：高脂血症特异性蛋白冠介导银纳米颗粒加剧动脉粥样硬化的机制研究

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背景介绍

心血管疾病（CVD）是全球死亡和致残的主要原因，动脉粥样硬化作为其核心病理基础，与脂质代谢密切相关。高胆固醇血症是动脉粥样硬化的重要危险因素——正常血清总胆固醇水平应低于5.2 mM，而超过6.2 mM即被归类为高胆固醇血症。流行病学数据显示，全球约39%的成年人存在总胆固醇升高，中国成人血脂异常患病率高达35.6%。与此同时，银纳米颗粒（AgNPs）因独特的物理化学性质在食品添加剂和医药工业等领域广泛应用，导致人体不可避免的暴露。一旦纳米颗粒进入生物体液，会迅速与蛋白质相互作用形成“蛋白冠”（protein corona），这一生物界面将显著改变纳米颗粒的理化性质、生物学行为和毒理学效应。然而，疾病状态下（尤其是高胆固醇血症）蛋白冠的组成变化及其对动脉粥样硬化进程的影响，迄今尚不清楚。

研究思路

针对上述挑战，南开大学环境科学与工程学院祝凌燕教授和Zhang Yinqing教授团队系统研究了高胆固醇血症条件下AgNPs表面蛋白冠的形成规律及其对动脉粥样硬化的影响机制。研究发现，血清胆固醇水平升高显著促进了低分子量疏水蛋白在AgNPs表面的选择性吸附——蛋白组学分析显示，随胆固醇浓度从0.7 mM升至6 mM，AgNPs表面吸附蛋白从473种降至315种，其中低分子量（<50 kDa）疏水蛋白占比从71%增至83%。这种高脂血症特异性蛋白冠通过脂筏依赖、清道夫受体B1（SR-B1）介导的内吞途径促进巨噬细胞摄取AgNPs，改变胞内运输轨迹靶向内质网和高尔基体，并利用高尔基分泌囊泡进行胞吐。由于动态的胞内蛋白交换，AgNPs通过招募分子伴侣触发内质网应激（ERS），进一步激活未折叠蛋白反应（UPR）——IRE1通路诱导达2.31倍，PERK和ATF6通路分别上调1.60和1.45倍。ERS促进巨噬细胞M1型极化和脂质蓄积（CE含量显著升高，胆固醇外排能力降低34%），最终驱动泡沫细胞转化。体内ApoE⁻/⁻小鼠模型证实AgNPs加速动脉粥样硬化进展（斑块面积从10.8%增至25.4%），而ERS抑制剂4-PBA可显著逆转这一效应。相关内容以Hyperlipidemia-Specific Protein Corona Formed on Silver Nanoparticles Aggravates Atherosclerosis by Facilitating Macrophage Lipid Accumulation发表在ACS Nano！

图片解析

图1. 高脂血症特异性PC-AgNPs触发巨噬细胞脂质蓄积： (a) 典型油红O染色图像（标尺10 μm）和(b) BODIPY 493/503共聚焦显微图像（标尺10 μm，绿色），显示ox-LDL与PC-AgNPs共处理后的脂质蓄积。(c) 油红O阳性面积和BODIPY 493/503荧光强度定量，Cho(6)-PC-AgNPs和Cho(12)-PC-AgNPs组分别为对照组的1.65倍（p<0.01）和2.39倍（p<0.01）。(d) 胞内总胆固醇（TC）、游离胆固醇（FC）、胆固醇酯（CE）和总甘油三酯（TG）含量定量，PC-AgNPs（高胆固醇水平形成）显著增加TC、FC和TG含量（p<0.05）。(e-f) Dil-ox-LDL结合实验共聚焦图像及相对荧光强度，仅AgNPs组上调胆固醇摄取。(g) NBD-胆固醇外排实验共聚焦图像及相对荧光强度，Cho(6)-PC-AgNPs和Cho(12)-PC-AgNPs组胆固醇外排能力分别降低至对照组的0.74倍和0.66倍（p<0.05）。

图2. 胆固醇在AgNPs表面EPC形成中的关键作用： (a) 不同胆固醇水平下AgNPs表面蛋白吸附行为，吸附量从108.9±22.1增至288.1±14.5 μg/mg NPs。(b) Cho(0.7)-PC-AgNPs、Cho(3)-PC-AgNPs和Cho(6)-PC-AgNPs中重叠蛋白的韦恩图。(c) 聚类前10蛋白热图及对应分子量（MW）和总平均疏水性（GRAVY）值，上调蛋白主要为MW<50 kDa、GRAVY>-0.2的疏水蛋白。(d) 胆固醇在AgNPs上的吸附行为。(e-i) 冠层蛋白按分子量（e）、疏水氨基酸百分比（f）、理论等电点（g）、芳香族氨基酸百分比（h）和氢键相关氨基酸百分比（i）的分类。(j) RFC模型确定的蛋白质理化特性对选择性吸附的加权重要性，MW贡献37.2%，疏水氨基酸比例贡献19.7%。

图3. 巨噬细胞对Cho-PC-AgNPs内吞的促进作用： (a) EPC中上调及不变蛋白的GO和KEGG通路（内吞或胞吐相关）分析。(b) 不同胆固醇浓度FBS中形成的PC-AgNPs暴露后胞内总Ag浓度和(c)颗粒态Ag浓度，Cho(6)-PC-AgNPs和Cho(12)-PC-AgNPs组分别为7.3±0.5和9.5±0.8（×10⁻¹⁰ μmol·cell⁻¹）。(d) 不同药理抑制剂存在下PC-AgNPs的细胞摄取机制对比，Cho(6)-PC-AgNPs组中MβCD和BLT-1显著抑制内吞。(e-f) SR-B1敲低的qPCR和Western blot验证。(g) SR-B1敲低对Cho(6)-PC-AgNPs内吞的影响（**p<0.05）。(h) 分子对接预测的调理素或负调理素蛋白与胆固醇的结合亲和力。(i) AgNPs吸附蛋白的Reactome分析及对应信号通路。

图4. AgNPs的胞内旅程： (a) 不同药理抑制剂存在下PC-AgNPs的胞吐机制对比，brefeldin A和monensin对Cho(6)-PC-AgNPs胞吐的抑制更显著。(b) 高尔基体活性抑制剂Exo1处理后Cho(6)-PC-AgNPs在巨噬细胞中的荧光强度定量（p=0.027）。(c) 基于GO分析的不同胆固醇浓度下AgNPs表面差异蛋白的细胞组分分类。(d) 不同GO分类术语蛋白相对丰度变化，高尔基体相关蛋白在高胆固醇条件下显著上调。(e) 三种特异性蛋白冠（EPC、IPC-12 h、IPC-24 h）的蛋白量定量。(f) IPC-12 h和IPC-24 h中显著上调或下调蛋白的相对丰度。(g) GRP78与Cho(0.7)-PC-AgNPs（上）和Cho(6)-PC-AgNPs（下）的结合动力学和解离常数，高胆固醇组Kd更低（p<0.05）。(h) GO分析中上调/下调蛋白按细胞组分的分类。(i) Cho-PC-AgNPs的胞内旅程及基于动态IPC谱的胞内转运示意图。

图5. PC-AgNPs加剧动脉粥样硬化效应的机制： (a) IPC中参与未折叠蛋白结合过程的蛋白占比。(b) IPC-12 h和IPC-24 h中ATP依赖的蛋白折叠分子伴侣占比（23.4%和52.6%）。(c) KEGG分析富集的“内质网蛋白加工”通路。(d) ERS标志物（GRP78、IRE1、PERK、ATF6、XBP1、ATF4、CHOP、HERPUD1）表达及4-PBA的逆转效应，Cho(6)-PC-AgNPs使GRP78上调1.64倍（p<0.05），IRE1上调2.31倍。(e) 胞内Ca²⁺水平变化。(f) M1（CD86、iNOS、IL-6）和M2（CD206、Arg1）极化标志物表达及4-PBA逆转效应。(g) 脂质代谢相关基因（ACAT1、ABCA1、ABCG1、SR-B1）表达。(h) 4-PBA对脂质蓄积的逆转效应示意图。

图6. AgNPs加速高脂血症小鼠动脉粥样硬化进展： (a) 动物实验设计。(b) 油红O染色全主动脉代表性图像及(c) 阳性面积分析，AgNPs使HFD组阳性面积从10.8%增至25.4%，4-PBA联合处理降至11.4%。(d-g) 血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平。(h) 计算的动脉粥样硬化指数（AI），AgNP处理组AI增加约3倍。(i) 主动脉根部H&E、Masson及CD68和GRP78免疫组化染色代表性图像（蓝色星号：典型斑块，绿色和红色星号：胆固醇结晶和泡沫细胞）。(j) 斑块面积、(k) 胶原含量、(l) CD68阳性面积和(m) GRP78阳性面积定量分析（n=3，p<0.1，p<0.05，p<0.01，****p<0.001）。

图7. 高脂血症特异性AgNPs蛋白冠形成及胞内演化过程及AgNPs通过分子伴侣吸附和内质网应激加剧动脉粥样硬化效应的示意图： 高胆固醇血症血清中低分子量疏水蛋白选择性吸附于AgNPs表面→形成高脂血症特异性EPC→通过脂筏依赖、SR-B1介导的内吞进入巨噬细胞→靶向内质网和高尔基体→胞内分子伴侣（GRP78等）吸附→激活ERS/UPR（PERK、IRE1、ATF6通路）→M1型巨噬细胞极化→脂质蓄积和胆固醇外排受损→泡沫细胞转化→加剧动脉粥样硬化。

结论

本研究首次系统揭示了高胆固醇血症微环境对AgNPs蛋白冠组成的调控规律及其在动脉粥样硬化进展中的关键作用。高血清胆固醇通过增强疏水相互作用和位阻效应，促进低分子量疏水蛋白在AgNPs表面的选择性吸附，形成高脂血症特异性蛋白冠。该蛋白冠通过脂筏依赖、SR-B1受体介导的内吞途径增强巨噬细胞对AgNPs的摄取，改变胞内运输轨迹使其靶向内质网和高尔基体，并通过高尔基分泌囊泡进行胞吐。动态胞内蛋白冠演化显示，AgNPs通过招募分子伴侣（GRP78等）触发ERS，激活PERK、IRE1和ATF6三条UPR通路（IRE1上调达2.31倍），进而促进M1型巨噬细胞极化和脂质蓄积（胆固醇酯化增强、外排能力降低34%），最终驱动泡沫细胞转化。体内ApoE⁻/⁻小鼠模型证实AgNPs使斑块面积增加2.3倍，而ERS抑制剂4-PBA可显著逆转这一效应。该研究阐明了生理病理微环境对纳米-生物相互作用的深刻影响，为理解环境纳米颗粒在代谢性疾病背景下的健康风险提供了重要机制洞见。