Phytomedicine：风湿宁通过调节肠道菌群缓解类风湿性关节炎的新机制

类风湿性关节炎（RA） 是一种常见的慢性自身免疫性疾病，主要影响关节，尤其是小关节，引发炎症、肿胀、疼痛和功能丧失，其特征性病理改变包括侵袭性滑膜炎和关节软骨及骨质破坏，最终可导致关节畸形和永久性功能障碍。RA 的发病与免疫系统异常激活密切相关，免疫细胞攻击正常关节组织，尤其是滑膜，引发炎症反应，其发病因素包括遗传易感性、环境暴露、肠道菌群失调、免疫调节紊乱及肠道屏障功能障碍等。

目前临床治疗 RA 主要依赖抗炎药物（如氨基水杨酸类和糖皮质激素）、抗生素和免疫抑制剂，但这些疗法只能缓解症状，可能引发严重不良反应，因此需要探索新的干预方法。近年来，多项研究表明肠道菌群失调与 RA 的发病机制有关，RA 患者的整体微生物多样性显著降低，致病菌增多，有益菌减少，且肠道微生物通过产生多种代谢物来促进宿主生理功能，其中短链脂肪酸（SCFAs）是肠道微生物发酵膳食纤维产生的，在调节免疫系统攻击自身组织以及直接作用于关节组织改善局部炎症和缓解 RA 症状方面发挥重要作用。丁酸是研究最广泛的 HDAC 抑制剂，可抑制 HDAC 活性，增加组蛋白乙酰化水平，提高抗炎基因水平，从而减轻 RA 中的炎症反应。

近期，在Phytomedicine期刊上发表了一项题为“HDAC/NF-κB signaling pathway mediates gut microbiota dysbiosis in rheumatoid arthritis: Intervention mechanisms of Fengshining decoction”的研究，旨在评估中药风湿宁（FSN）  对 RA 的肠道微生态机制影响，重点研究肠道源性 SCFAs（尤其是丁酸）在 RA 治疗中的作用，以及 HDAC/NF-κB 信号通路在 FSN 对 RA 发挥作用中所起的作用，以阐明 FSN 是如何通过调节肠道菌群来缓解 RA 的。

在这项研究中，研究人员选取 80 只 SPF 级雌性 C57BL/6J 小鼠，适应性喂养一周后，随机分为 10 组，包括对照组、模型组（CIA 组）、甲氨蝶呤（MTX）组、不同剂量 FSN 组、FSN 粪菌移植组（FSN-FMT 组）、伪无菌模型组（ATBX 组）、模型 + 丁酸组（CIA+BUT 组）、伪无菌模型 + 丁酸组（ATBX+BUT 组）等。通过牛Ⅱ型胶原和弗氏完全佐剂乳化后注射小鼠尾部、背部及左足底制备 CIA 模型，除对照组、CIA 模型组和伪无菌 CIA 模型组给予生理盐水外，其余各组分别给予相应药物或处理。在细胞实验中，研究人员将成纤维样滑膜细胞（FLS）在含 10% 胎牛血清和抗生素的 DMEM 培养基中培养，并进行细胞增殖实验、细胞凋亡检测、细胞骨架染色、划痕实验等。

通过收集小鼠粪便样本进行宏基因组测序和代谢组分析；收集关节组织进行病理学染色（Masson 三色染色、Safranin O/Fast Green 染色、AB-PAS 染色等）、免疫组化检测、免疫荧光检测等；收集血清样本进行酶联免疫吸附试验（ELISA）检测炎症因子水平；收集组织和细胞进行 Western blot 分析检测相关蛋白表达。

研究方法

宏基因组测序 ：提取小鼠粪便样本中的基因组 DNA，进行 PCR 扩增和纯化，构建测序文库，利用 Illumina HiSeq 高通量测序平台对肠道微生物组基因组进行测序分析，以评估肠道菌群的组成、多样性和功能变化。

代谢组分析 ：取小鼠血清样本，经过一系列处理后，采用 UltiMate3000 高效液相色谱系统进行分析，结合质谱条件，对血清中的代谢物进行定性和定量分析，以探究不同组之间的代谢差异。

病理学评估 ：对小鼠关节组织进行固定、包埋、切片后，采用不同的染色方法进行染色，观察关节组织的病理变化，如炎症细胞浸润、软骨破坏、滑膜增生等，并进行定量分析。

免疫组化与免疫荧光检测 ：对小鼠肠道组织进行固定、包埋、切片后，进行抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育等步骤，通过 DAB 显色或荧光染色，检测肠道组织中特定蛋白的表达和定位，并进行定量分析。

Western blot 分析 ：收集小鼠关节组织和细胞，利用 RIPA 裂解缓冲液提取蛋白，经 BCA 法定量后，进行 SDS-PAGE 电泳分离，转膜至 PVDF 膜上，封闭后孵育一抗和二抗，使用 ECL 显色剂显色，分析蛋白表达水平。

研究结果

FSN 对 RA 症状的改善

在胶原诱导的关节炎（CIA）小鼠模型中，经过 21 天的不同剂量 FSN 处理后，关节肿胀得到缓解，足爪厚度减少，且 H&E 染色显示 FSN 治疗组和阳性对照组的病理变化（如炎症细胞浸润、成纤维细胞增殖、新生血管形成、软骨表面降解等）显著改善，Masson 染色和 Safranin O-Fast Green 染色结果显示 FSN 治疗减轻了关节损伤和胶原纤维沉积，Micro-CT 分析显示 FSN 对骨侵蚀具有保护作用。

FSN 对肠道菌群的调节作用

宏基因组测序分析发现，与对照组和 FSN 治疗组相比，CIA 小鼠的肠道菌群发生显著变化，微生物群落向促炎方向转变，结肠微生物多样性降低，且与脂多糖生物合成和鞘脂代谢途径的激活相关，而精氨酸和脯氨酸代谢途径受到抑制。CIA 组中有益的 SCFA 产生菌（如 Butyrivibrio、Faecalicatena 和 Lacrimispora）的丰度显著降低，而有害菌（如 Alistipes、Proteus、Muribaculum 和 Prevotella）的丰度显著增加，FSN 治疗减少了有害菌的丰度，增加了有益菌的丰度，FMT 组的肠道菌群组成整体上与对照组相似。

FSN 对 SCFAs 产生的促进作用

代谢组分析显示，FSN 治疗逆转了 CIA 小鼠粪便样本中差异代谢物的变化趋势，如 S- 腺苷甲硫氨酸、甜菜碱、鸟嘌呤和油酸等代谢物的水平变化。差异代谢物与苯丙氨酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸代谢、不饱和脂肪酸生物合成和脂肪酸延长等四种代谢途径显著相关，且丁酸和油酸的水平与关节炎相关的炎症标志物以及 HDAC1 和 HDAC2 的表达呈显著负相关，与 g_Ruthenibacterium 呈正相关。

图：FSN抑制RA的病理进展

FSN 对肠道屏障功能的恢复作用 

免疫荧光染色显示，CIA 组小鼠肠道中 p65 阳性细胞数量增加，经 FSN 治疗后显著减少。AB-PAS 染色显示 CIA 组小鼠肠道黏膜屏障受损，杯状细胞数量显著减少，FSN 治疗减轻了肠道炎症诱导的杯状细胞丢失，减少了酸性黏液分泌，恢复了黏膜屏障。H&E 染色显示 FSN 高剂量治疗组小鼠肠道黏膜结构完整，仅出现轻度间质松解和水肿，肌层和浆膜层结构正常。免疫组化结果显示 FSN 给药后 MUC2 的表达显著上调，而 CIA 小鼠中 MUC2 的表达显著下调。Western blot 分析进一步证实了 FSN 显著逆转了 RA 诱导的紧密连接蛋白（ZO-1 和 Occludin）表达变化，并抑制了结肠中 TLR4、TRAF6 和 MyD88 等炎症信号蛋白的表达。

图：FSN通过调节肠道菌群缓解RA

FSN 对 HDAC/NF-κB 信号通路的抑制作用

Western blot 分析显示，与 CIA 组相比，FSN 治疗抑制了 HDAC1、HDAC2、p65 和磷酸化 p65（P-p65）的信号传导。细胞经 HDAC1/2 抑制剂 TSA 和 NF-κB 抑制剂 PDTC 处理后，部分抑制了滑膜成纤维细胞中 p65 和 HDAC 的炎症表达。此外，FSN 还降低了 CIA 小鼠血清中促炎细胞因子 IL-1β 和 IL-6 的水平。流式细胞术分析显示，与对照组相比，CIA 小鼠的滑膜成纤维细胞凋亡率明显降低，而给予 FSN 含药血清和 HDAC1/2 或 NF-κB 抑制剂后，凋亡率升高。鬼笔环肽染色结果显示，TNF-α 刺激增强了 F-肌动蛋白的荧光强度，促进了 FLS 细胞伪足 / 突起的形成以及细胞骨架应力纤维的重组，而 FSN 及相应抑制剂可缓解这些异常变化。

研究结论

FSN 可显著缓解 CIA 小鼠的症状，降低血清中炎症细胞因子水平，其肠道微生态机制可能与其草药成分调节肠道菌群多样性、恢复肠道屏障以及增强微生物代谢物产生有关，且丁酸在调节肠道黏膜、抑制炎症反应、修复肠道屏障以及减轻关节损伤方面发挥了重要作用，从而缓解了 RA 症状。

该研究为 FSN 作为一种潜在的 RA 治疗药物提供了科学依据，同时也进一步证实了肠道菌群及其代谢物在 RA 发病机制中的重要性，为未来的 RA 治疗研究提供了新的方向，即通过调节肠道菌群及其代谢物来干预 RA 的进程。

原始出处

Wen Y, Li M, Hao Y, et al. HDAC/NF-κB signaling pathway mediates gut microbiota dysbiosis in rheumatoid arthritis: Intervention mechanisms of Fengshining decoction. Phytomedicine. Published online June 16, 2025. doi:10.1016/j.phymed.2025.156976