北京大学《自然·通讯》：氢溴酸山莨菪碱靶向Matk预防延迟rtPA溶栓诱导的缺血性卒中血管源性脑水肿

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背景介绍

缺血性卒中是最常见的脑血管疾病，重组组织型纤溶酶原激活剂（rtPA）是急性缺血性卒中的标准溶栓疗法，指南推荐在症状发作后4.5小时内给药。然而，临床实践中延迟rtPA治疗（超出治疗时间窗）十分常见，可加剧血脑屏障破坏、血管源性脑水肿（发生率为10%-40%）和死亡率。目前尚无针对延迟溶栓诱导的血管源性脑水肿的药理学治疗方法。因此，亟需开发能够稳定血脑屏障、减轻溶栓后微血管通透性增加的辅助治疗策略。

研究思路

针对上述挑战，北京大学基础医学院刘建博士团队提出氢溴酸山莨菪碱（Ani）——一种已在中国临床用于治疗血管性头痛、视网膜血管痉挛和缺血性视神经病变的生物碱——可能通过靶向巨核细胞相关酪氨酸激酶（Matk）预防延迟rtPA溶栓诱导的血管源性脑水肿。该团队首先在FeCl₃血栓形成联合rtPA溶栓的小鼠缺血性卒中模型中证实，Ani治疗可提高生存率、改善神经功能、保护血脑屏障完整性。通过蛋白质组学和HuProt™人类蛋白质组微阵列筛选，结合分子对接、分子动力学模拟、表面等离子体共振和pull-down实验，发现Matk是Ani的直接作用靶点。Ani与Matk结合后稳定其蛋白水平，抑制其泛素-蛋白酶体途径降解，进而抑制Src激酶活化（Tyr419磷酸化减少、Tyr530磷酸化增加），阻断Src介导的VE-钙黏蛋白（Tyr658）和Caveolin-1（Tyr14）磷酸化，从而同时抑制旁细胞和跨细胞渗漏途径。通过体外Matk敲低/过表达和体内内皮特异性AAV介导的Matk调控实验，验证了Matk在Ani保护血脑屏障中的关键作用。相关内容以“Anisodine hydrobromide targets matk and prevents delayed rtPA thrombolysis-induced vasogenic cerebral edema in ischemic stroke”为题，发表在Nature Communications！

图片解析

图1. Ani提高rtPA溶栓缺血性卒中小鼠的生存率、减轻神经功能缺损和血管源性脑水肿：(A) Ani的化学结构和分子式。(B) 实验流程及分组。(C) 各组小鼠7天生存率，Ani治疗组显著提高生存率。(D-E) NES和mNSS神经功能评分，Ani组显著改善。(F-G) 激光散斑血流成像及定量分析，Ani治疗不影响脑血流恢复。(H-I) 伊文思蓝外渗代表性图像及定量，Ani显著减少血脑屏障渗漏。(J) 脑含水量定量，Ani降低脑水肿。

图2. Ani抑制rtPA溶栓诱导的缺血性卒中小鼠脑微血管渗漏：(A-B) FITC-葡聚糖渗漏的代表性图像及定量（I/V比值），Ani减少微血管渗漏。(C) ZO-1、JAM-1、Occludin和Claudin-5的Western blot，Ani恢复紧密连接蛋白表达。(D) Occludin免疫荧光，Ani改善其连续分布。(E) VE-钙黏蛋白、α-连环蛋白和β-连环蛋白的Western blot，Ani恢复VE-钙黏蛋白和α-连环蛋白。(F) VE-钙黏蛋白免疫荧光，Ani恢复其连续性。(G) p-Caveolin-1 (Tyr14)、Caveolin-1、p-Src (Tyr419)和t-Src的Western blot，Ani抑制Src和Caveolin-1磷酸化。(H) p-Src (Tyr419)和p-Caveolin-1 (Tyr14)免疫荧光，Ani降低其表达。(I-K) 透射电镜图像及定量，Ani减小内皮细胞间隙宽度并减少囊泡数量。

图3. 蛋白质组学分析和HuProt™人类蛋白质组微阵列鉴定Matk为Ani的潜在靶点：(A) 蛋白质组学差异蛋白热图。(B-C) GO富集分析。(D) Ani-生物素的化学结构。(E) HuProt™微阵列阳性蛋白的GO富集分析。(F) 蛋白质组学候选蛋白（40个）与HuProt™小分子结合类别阳性蛋白（239个）的Venn图，交集5个蛋白。(G) 微阵列上5个蛋白的荧光强度倍数变化排序。(H) 5个蛋白与Ani的亲和力打分。(I) Matk在微阵列上的荧光定位（红箭头：阳性对照，粉箭头：阴性对照，黄箭头：Matk）。

图4. Ani直接与Matk相互作用并抑制其泛素介导的降解：(A) 分子对接分析显示Ani与Matk结合。(B) 100 ns分子动力学模拟结果。(C) 氢键占有率分析。(D) MM/GBSA结合自由能计算。(E) 残基能量分解。(F) 计算丙氨酸扫描，Trp122、Ser197和Met190是关键残基。(G) SPR分析显示Ani与Matk结合，Kd=2.12×10⁻⁶ M。(H) Pull-down实验证实Ani直接结合Matk。(I) CETSA显示Ani稳定Matk抵抗热降解。(J) 小鼠脑组织中Matk Western blot，Ani恢复rtPA溶栓诱导的Matk下降。(K-L) HCMECs中Matk Western blot和免疫荧光，Ani恢复OGD/R诱导的Matk下降。(M-N) MG132（蛋白酶体抑制剂）而非氯喹（溶酶体抑制剂）阻断Matk降解，Ani抑制降解。(O) Matk泛素化分析，Ani减少OGD/R诱导的Matk泛素化。

图5. Matk通过Src信号调节介导Ani对HCMECs内皮屏障功能的保护：(A-B, F-G, J-K) FITC-葡聚糖渗漏和TEER测定，Matk敲低消除Ani的保护作用，Matk过表达模拟Ani效应。(C, I, M) Western blot分析Matk、Src磷酸化、VE-钙黏蛋白磷酸化、Caveolin-1磷酸化及ZO-1，Ani调节这些蛋白表达，Matk敲低逆转之。(D) 小鼠脑组织中p-Src (Tyr530)和p-VE-钙黏蛋白 (Tyr658)的Western blot，Ani恢复p-Src (Tyr530)并抑制p-VE-钙黏蛋白。(E, H, L) 免疫荧光显示Matk、p-Src (Tyr419)和VE-钙黏蛋白，Matk敲低消除Ani对p-Src的抑制和VE-钙黏蛋白的恢复。

图6. 内皮细胞特异性Matk敲低阻止Ani对rtPA溶栓后缺血性卒中小鼠微血管渗漏的保护作用：(A-B) FITC-葡聚糖渗漏图像及定量，Matk敲低取消Ani的保护。(C-D) 伊文思蓝外渗定量，结果一致。(E) 分离的脑内皮细胞Western blot，Matk敲低逆转Ani对Src、VE-钙黏蛋白、Caveolin-1和ZO-1的调节。(F) 免疫荧光显示Matk、p-Src (Tyr419)、p-Caveolin-1 (Tyr14)和VE-钙黏蛋白，Matk敲低阻止Ani的效应。(G-I) 透射电镜图像及定量，Matk敲低取消Ani对紧密连接宽度和囊泡数量的改善。

图7. 内皮细胞特异性Matk过表达减少rtPA溶栓后缺血性卒中小鼠的微血管渗漏：(A-B) FITC-葡聚糖渗漏图像及定量，Matk过表达减少渗漏。(C-D) 伊文思蓝外渗定量，结果一致。(E) 分离的脑内皮细胞Western blot，Matk过表达模拟Ani效应，且与Ani无叠加。(F) 免疫荧光显示Matk、p-Src (Tyr419)、p-Caveolin-1 (Tyr14)和VE-钙黏蛋白，Matk过表达产生与Ani相似的保护作用。(G-I) 透射电镜图像及定量，Matk过表达改善紧密连接和囊泡。

图8. 机制示意图： 延迟rtPA促进Matk降解，减少Matk介导的Src Tyr530磷酸化，增加Src Tyr419磷酸化活化。活化的Src通过磷酸化Caveolin-1 (Tyr14)促进跨细胞渗漏，通过磷酸化VE-钙黏蛋白 (Tyr658)促进旁细胞渗漏并下调ZO-1和VE-钙黏蛋白。Ani结合Matk，阻止其降解，恢复Matk水平，维持Src失活状态，减少Caveolin-1和VE-钙黏蛋白磷酸化，保护ZO-1/VE-钙黏蛋白表达和定位，最终减轻血管源性脑水肿。

结论

本研究首次揭示氢溴酸山莨菪碱（Ani）可通过直接靶向Matk，抑制其泛素-蛋白酶体降解，稳定Matk蛋白水平，进而抑制Src激酶活化及其下游VE-钙黏蛋白（Tyr658）和Caveolin-1（Tyr14）的磷酸化，从而同时阻断延迟rtPA溶栓诱导的旁细胞和跨细胞渗漏途径，保护血脑屏障完整性，减轻血管源性脑水肿，提高小鼠生存率和神经功能。该研究鉴定了Matk-Src信号轴作为治疗靶点，并为Ani作为预防溶栓后脑水肿的临床候选药物提供了理论依据。Ani已在中国临床获批使用，具有良好的安全性，其在雌性小鼠中同样有效，支持其临床转化潜力。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41467-026-73995-0