高中风险地区大规模筛查新冠核酸检测经验分享

2022.3.14-2022.4.22，湖南省支援吉林核酸检测队157人在长春工作生活共40天，完成新冠核酸检测112.23万管，服务超1000万人次。

笔者工作的主要阵地是位于长春五环体育馆内的广州金域“猎鹰号”硬气膜实验室。金域医学这三年在全国各地进行大规模核酸检测，从物资供应、标本接收、标本信息登记与预处理、样本流转、阳性结果上报等方面，有非常丰富的经验，流程方面也很顺畅。而笔者及同伴作为专门进行核酸检测的工作人员，主要负责一区试剂配制、二区样本制备、三区扩增，也是这个气膜实验室的核心动力。

长春的核酸检测和以往不一样，阳性非常多，浓度也很高，遇到的很多问题是前所未有的。以下，我将分别从三个区域遇到的不同问题以及需交流的问题进行总结和分析。

1. 一区试剂配制

试剂配制是核酸检测的第一步，也是全流程完善完备的起跑线，决定了后续工作的有效性。

1.1 时间及流程优化建议

气模实验室每天的检测任务一般是4-8万管，因此，试剂配制工作量非常大，节约时间、提高效率是很重要。可以从以下几方面节约时间：

1.扩增试剂的提前解冻。现场后勤工作人员可以根据标本量，在核酸检测人员到达场地的1-2小时前将一定比例的扩增试剂放置室温，提前解冻。

2.扩增试剂的反应液与酶可以数支按照正确比例同时倒入50ml离心管中进行混匀，而不是分别混合混匀。这样可以节约开盖拧盖的次数，减少污染，省时省力。

3.使用全自动液体工作站进行自动分液，而不是使用排枪分液。排枪分液操作要求高，连续使用移液器枪头会松动，易导致分液体积不准。使用全自动液体工作站省时、省力、精准度高。

1.2 注意事项

1.试剂配制的量尽可能与检测量齐平。试剂配制后，放置时间过久，将导致酶失活，出现假阴性；以及探针断裂致使荧光基团和淬灭基团游离，扩增出现假的单基因起跳情况。在人员充足的情况下，可以安排专人在一区根据实际检测量进行动态的试剂配制。

2.动作轻柔，严防人源性污染。物品进入一区前，应该消毒。尽量减少未被防护装备遮盖的身体部位直接与一区内物品接触。试剂混合、分液、分装动作都应轻柔，手套避免接触管口、管盖等部位。

2. 二区样本制备

样本制备是核酸检测中工作量最重、最繁琐的一个区域，人员多、岗位多、设备杂、空间拥挤。样本制备的每一个步骤都至关重要。

2.1 时间及流程优化建议

1.由于岗位复杂，建议各个岗位的人员相对固定，可以降低失误率。

2.标本接收后，需震荡混匀，10混1管和20混1管需适当延长震荡时间。震荡完成，静置5分钟后，再进行加样，减少开盖时的液体飞溅和气溶胶污染。

3.每行标本的首尾应使用标记笔进行标记和编号。

4.如果加样错误，如果能明确知道加样错误位置，在布板单上标注清楚；如不明确，需整板重做。

5.加样完成后，标本的摆放：可按照加样人的不同分开摆放。在标本架上用便签纸粘贴板号以及加样人-加样板信息，如“某某-1”，以方便查找。同时，流转单上也需标注。

6.标本的丢弃：整板标本结果上传完毕，由三区核对后发出指令，二区人员方可丢弃标本（每板标本分别打包丢弃，黄色小垃圾袋外标注板号）。如遇某板标本中有复查标本，此板标本需暂存，直至复查完毕。

7.复查需单独布板，且相邻位置尽量不同时加阳性复查标本。

2.2 注意事项

1.核酸提取过程所有的试剂（裂解液、洗涤液、磁珠、洗脱液等）都应属于同一批号，写上板号和顺序号，且标记的位置朝向一致。

2.如因试剂顺序摆放错误导致无扩增结果，需整板重做。

3.提取试剂使用前需抽样检查底部是否有结晶形成，胍盐结晶可导致磁珠吸附和释放效能降低，造成核酸提取失败。如因为气温太低导致的结晶，需37摄氏度复温，其他原因导致的结晶，需更换试剂。

4.提取完成后，若发现磁棒套残留磁珠过多，以及洗脱液内残留磁珠，此台提取仪应停用，联系仪器工程师。

5.点样和贴膜/加盖岗位，尤其需注意手套导致的携带污染，需常更换或消毒。

6.若加样人员发现采样管内无拭子，一律按退单处理（环境采样除外）。

7.上机前需将96孔板瞬时离心后方可上机扩增，如叠放，需考虑离心力是否会将远端板的贴膜挤压，导致密封性降低。

3. 三区扩增及分析

由于气膜实验室内的PCR扩增仪可能品牌和型号众多，扩增区工作人员应对不同PCR扩增仪都有一定的了解，进舱前熟悉操作。扩增区的操作人员，应当熟练掌握荧光PCR的原理、CT值的意义、基线的调整、阴阳性质控的意义、结果的判读等，且细心、谨慎。

3.1 时间及流程优化建议

1.阳性或弱阳性结果，需双人确认，双签字。

2.每批复查的布板单和原始单都应汇总在一起，简单装订，方便核实。

3.原始单最下面结果分析部分，应该对该板结果进行总结，如“全阴”、“1个内标未起复查”、“1个双阳复查”、“1个单阳复查”等，并签名，以便结果录入。

3.2 注意事项

1.注意扩增仪的荧光信号收集方式，是侧面扫描或顶部扫描。如侧面扫描，则不能使用不透明的扩增管。如果顶部扫描，则不能使用硅胶盖板或不透明/磨砂的八连管盖。

2.所有的扩增管上机前，需再次确认每个管管盖严密性。

3.扩增仪上机后，需标注阴性和阳性质控位置，其余的样本孔需编号，与布板单一致。

4.尽量在程序结束、冷却后再打开扩增仪热盖，防止爆盖。

5.结果分析时，不同的试剂尤其需要注意各个通道代表的是哪种靶基因，不能混淆。

6.结果分析时，如扩增曲线出现斜线、非正立的S型曲线等情况，需注意查看原始曲线，并调整基线，重新分析。

7.不同的试剂进行同一管阳性标本复查时，两者CT值的差距需要在合理范围内（根据程序设置方式、点样量、总体积等提前计算）。

8.出现非常靠后的单基因起跳，无论说明书是否已经判断为阴性，都应该进行双试剂复查。在病例较多的地区，患者呼吸道排毒量个体差异较大，非常靠后的单基因起跳，可能是少量排毒期，排除污染后，可上报可疑。

9.有效控制舱内温度，多台扩增仪散热量巨大，应减少由于环境温度过高导致扩增仪损坏。

4. 各区域交流环节

各区之间的交流是很重要的，下面对各区都需注意或涉及到的注意事项进行总结。

1.扩增试剂在点样前和点样后，都应该避免紫外线的照射，尽量避光。

2.每一板标本的流转都应该随时携带流转单，流转单上应标注板号、加样人-加样板如“某某-1”、提取人、提取仪编号、扩增上机人、扩增仪编号、结果分析人员等信息。

3.各区域之间尽量减少不必要的人员、物品流动。尤其避免人员和物品的逆向流动。如需流动，需做好消杀、严防产物污染。

4.如出现某一板有多个内标不出的情况，先确定是否为环境样本，检查采样管的基本情况。再通知二区将标本再次震荡后，更换加样人整板重新加样、更换提取仪提取、更换扩增仪进行扩增。如情况仍然未得到改善，可通知重新采样。

5.若初筛出现双阳标本，原管复查后变成阴性，应找出原始板，整板进行复查。

6.75%酒精能杀灭新冠病毒，防止生物危害，但是并不能有效防止产物污染，且易燃易爆。因此，杜绝核酸产物污染，尽可能使用含氯消毒液或核酸清除剂。

7.如大量标本出现ORF1ab或N基因翘尾，应先考虑核酸产物污染，实验室暂停使用。使用含氯消毒液或核酸清除剂进行全面消杀，尤其是一些隐秘位置，如试剂储存箱、冰箱门把手、提取仪及全自动分液工作站屏幕、排枪等。进行实验室内环境样本检测、无标本空白对照等多次试验，无污染后方可重新投入使用。

新冠核酸检测的原理和方法都不复杂，但在高中风险的地区进行大规模筛查，严防污染、保证结果准确性，需要注意的事项众多，笔者仅例举了其中的一部分，希望能够和各位同道不断地探讨。还有很多不足和不完善之处，敬请各位专家和同道不吝指出。

5. 专家点评

聂新民教授

中南大学湘雅三医院检验科主任

本文作者一直工作在大型公立医院核酸检测的第一线，今年带队支援河南安阳和吉林长春核酸检测，对核酸检测的每一步都有较深的体会，且善于思考和总结。

本文从一线核酸检测人员以及质量管理者的角度，从多个方面分析了高中风险地区大规模核酸检测中需要关注的注意事项，并提出了很多解决办法。文中指出的很多细节，是工作中往往容易忽视但非常关键的，值得检验同道们在工作中借鉴和探讨。

周细国教授

湖南省支援吉林核酸检测队总领队、湖南省临床检验中心教授

吉林长春的本次疫情，阳性样本多，质量控制难度大。本文作者作为该气膜实验室的主要质量负责人之一，从流程优化和注意事项入手，指出核酸检测操作过程中方方面面需要注意的细节，能够帮助各位同行们在今后遇到该类问题时及时分析原因，少走弯路。

这种经验总结分析值得推广，希望同行们提出宝贵意见，集百家之所长，更好地战胜新冠疫情。