Theranostics 山东大学齐鲁医院安丰双教授团队揭示rs12822146-KSR2轴调控动脉粥样硬化斑块进展的分子生物学机制

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冠状动脉疾病(CAD)目前仍是威胁人类健康的主要疾病之一，其病理基础是动脉粥样硬化。研究表明，遗传因素在CAD发生中起着关键作用，贡献度估计可达40%–70%。自2007年首个CAD全基因组关联研究(GWAS)发现9p21基因座与疾病风险显著相关以来，近18年来已有超过400个CAD相关单核苷酸多态性(SNP)位点被识别。目前，绝大多数SNP位点的生物学功能尚不明确。这些位点多数位于基因的非编码区域，例如内含子区，而其中约57%位于顺式调控元件(CRE)中，提示它们可能在特定细胞环境或病理状态下通过调控基因表达影响CAD的发生发展。因此，对这些遗传变异进行功能层面的精细定位与机制解析，对揭示CAD发病机理、开发新型防治策略具有重要科学意义。

2026年1月1日，山东大学齐鲁医院心内科和络病理论创新转化全国重点实验室安丰双教授团队在Theranostics发表题为“Endothelial KSR2 regulated by genetic variation protects against atherosclerosis through AMPKα1 stabilization”的研究论文，揭示CAD相关功能位点rs12822146能通过调控内皮细胞中KSR2基因表达，影响内皮细胞糖酵解过程，进而调节内皮炎症及凋亡，最终影响冠状动脉粥样硬化斑块的发生发展。该研究为冠心病早期风险预测和靶向干预策略的开发提供了新的理论依据与潜在靶点。

rs11830157(T>G)是一个在各种族人群中都高频突变的Tag SNP位点，其最小等位基因频率为29%，研究发现携带危险等位基因G的人群有更高的CAD发病率(OR = 1.12, p = 2.12×10^-9)。该位点位于染色体的12q24区域，既往研究发现该区域与血脂、血糖代谢异常及多种心血管疾病(如高血压、冠心病、心肌梗死)密切相关。值得注意的是，多项后续分析并未在rs11830157位点基因型与传统心血管危险因素(如血脂、血糖、血压)之间建立显著关联。这一结果提示，该位点可能并非通过影响传统代谢指标，而是直接作用于血管细胞功能，进而参与CAD的发生与发展过程。随后研究团队通过双荧光素酶报告基因实验发现，rs11830157位点在内皮细胞、平滑肌细胞及巨噬细胞中均未表现出明显的调控活性，暗示其本身可能并非直接的功能性位点。考虑到遗传位点间常因连锁不平衡而共同遗传，研究者转而检索ENCODE公共数据库，发现与rs11830157高度连锁的另一个SNP rs12822146周边存在明显的DNase I超敏感位点、CTCF结合信号以及组蛋白修饰标记H3K4me1和H3K27ac富集。这些特征提示，rs12822146可能位于某种顺式调控元件(如增强子)中，并具备调控基因表达的潜力。研究者通过双荧光素酶报告基因实验、染色质免疫沉淀(ChIP)、凝胶迁移实验(EMSA)及CRISPR-Cas9基因编辑技术等实验证实，rs12822146位点定位于内皮细胞特异性增强子区域，其等位基因可以差异性结合转录因子XBP1s，并调控内皮细胞KSR2表达。 

接下来，研究者分别在小鼠模型和人类冠状动脉临床样本中进行了验证，发现随着动脉粥样硬化斑块进展，内皮细胞中KSR2的表达逐渐降低。这一结果提示，内皮KSR2可能在动脉粥样硬化发生和发展过程中扮演重要角色。随后研究团队通过构建KSR2全敲小鼠自由高脂饮食喂养模型、KSR2与ApoE双敲小鼠配对高脂饮食喂养模型、内皮特异性KSR2过表达小鼠模型证实，内皮KSR2可以延缓动脉粥样硬化的进展。

转录组学结果表明，内皮KSR2主要调节免疫炎症、粘附功能、细胞凋亡、细胞代谢等信号通路。研究者通过体内外实验证实，内皮KSR2可以显著抑制内皮细胞炎症及凋亡，进而延缓动脉粥样硬化斑块进展。转录组学及既往研究结果均表明，KSR2与细胞能量代谢密切相关，而内皮细胞75%-85%的能量来源于无氧糖酵解。因此研究者猜测内皮细胞KSR2可能调控内皮细胞糖酵解，并进而抑制内皮细胞炎症及凋亡。随后，研究者通过seahorse糖酵解通量分析、细胞ATP/ADP比值测定、糖酵解相关酶(PFKFB-3、HK-2)表达分析等实验证明，KSR2可以稳定内皮细胞糖酵解，在静息状态下KSR2轻度促进内皮细胞糖酵解，而在oxLDL刺激情况下KSR2可以抑制内皮细胞过度增加的糖酵解，从而维持内皮细胞糖酵解通量在一个相对合理的范围。在体外通过糖酵解抑制剂2-DG证实，KSR2的抗内皮细胞炎症及凋亡作用通过平衡糖酵解介导。 

相较于同源蛋白KSR1，KSR2蛋白中有一段独特的CA2-CA3保守结构域，其被证实可以显著增加与AMPK蛋白的结合力，但具体调控机制尚不明确。AMPK是细胞能量代谢的关键感受器。因此研究者进一步在内皮细胞中探究KSR2对AMPK的影响及具体机制，发现内皮KSR2可以明显激活内皮细胞AMPK信号通路，这与既往研究结果一致。特别的是，内皮KSR2可以在不影响AMPKα1的mRNA水平的情况下，显著增加AMPKα1蛋白丰度。通过CHX追踪实验，并联合蛋白酶体抑制剂MG132、自噬抑制剂3-MA及溶酶体抑制剂CQ实验证实，KSR2可以抑制AMPKα1的蛋白酶体降解。随后，在内皮及293T细胞中进行泛素化实验分析证实，KSR2可以抑制AMPKα1蛋白的K48位多泛素化，而对M0、K6、K11、K27、K29、K33、K63位多泛素化无明显影响。以上结果证实，内皮KSR2通过抑制AMPKα1蛋白的K48位多泛素化-蛋白酶体降解途径增加AMPKα1蛋白丰度。

研究者进一步探究具体调控机制。KSR2作为支架蛋白，不存在泛素化酶或去泛素化酶活性。既往研究共发现7个E3泛素连接酶可以调节AMPKα1的蛋白稳定性。因此研究者进一步对这7个E3泛素连接酶进行筛选验证。随后证实，内皮KSR2抑制CUL4A^CRBN E3泛素连接酶对AMPKα1的K48位泛素-蛋白酶体降解。进一步研究发现，KSR2通过与CRBN蛋白竞争性结合AMPKα1蛋白的K52位点，抑制CUL4A^CRBN E3泛素连接酶对AMPKα1的K48位泛素-蛋白酶体降解，最后增加AMPKα1的蛋白稳定性。

最后，研究团队构建了内皮特异性敲减或过表达AMPKα1、CRBN小鼠，研究结果进一步证实内皮KSR2通过CUL4A^CRBN-AMPKα1通路影响动脉粥样硬化斑块的发生及发展。为了验证rs12822146位点多态性对内皮细胞KSR2及下游AMPK信号通路的影响，研究团队通过CRISPR-CAS9基因编辑构建了rs12822146位点单碱基突变的HUVECs (基因型TT)及野生型HUVECs (基因型CC)，结果证实突变型HUVECs中KSR2表达下调，同时AMPKα1蛋白丰度及AMPK信号通路活性显著下降。并且，以上变化在XBP1s抑制剂TUDCA的预处理后显著降低。

综上，本研究首次阐明了冠心病相关功能SNP位点rs12822146通过调控内皮细胞中KSR2的表达，进而影响CUL4A^CRBN E3泛素连接酶复合物对AMPKα1蛋白稳定性的调节作用，最终延缓动脉粥样硬化进程的完整分子通路。该发现为冠心病的早期风险预警和靶向治疗策略开发提供了新的理论依据和潜在干预靶点。

山东大学齐鲁医院心内科和络病理论创新转化全国重点实验室安丰双教授为本文的通讯作者，山东大学博士研究生刘铭为本文第一作者。山东大学齐鲁医院为第一和通讯作者单位。

原文链接：

https://www.thno.org/v16p2598.htm