安徽医科大学Biomaterials：磁控水凝胶封装结合芯片上处理增强小鼠卵母细胞麦管玻璃化冷冻

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背景介绍

卵母细胞冷冻保存在辅助生殖医学和生物多样性保护中具有重要应用价值。玻璃化冷冻通过超快速降温形成无定形玻璃态，有效防止破坏性冰晶形成，是实现卵母细胞长期保存的关键技术。然而，该方法所需的高浓度冷冻保护剂在加载和卸载过程中会使卵母细胞遭受严重渗透压冲击；此外，复温阶段也存在冰晶形成和再结晶风险，对卵母细胞造成损伤。这些固有局限性构成了当前冷冻保存方案的主要瓶颈。微流控技术通过形成连续浓度梯度有望减轻渗透损伤，但现有微流控平台仍面临细胞加载/回收效率低下和操作复杂等挑战，制约了卵母细胞冷冻保存的效果。

研究思路

针对上述挑战，安徽医科大学陈中嵘教授、中国科学技术大学赵刚教授与安徽医科大学程跃教授团队提出了一种结合微流控芯片和磁控水凝胶微胶囊的新颖冷冻保存策略。与传统受限于窄通道和复杂捕获结构的平台不同，该芯片设计有快速密封盖以提高样本处理效率，并通过将磁珠嵌入水凝胶基质，使系统无需复杂捕获结构即可防止细胞漂移和流失，同时提供物理屏蔽。磁控水凝胶使卵母细胞在微通道中可通过外部磁场操控，避免了微通道复杂捕获结构的设计，并在冷冻保存期间为卵母细胞提供物理保护。与传统麦管玻璃化相比，该方法显著提高了卵母细胞存活率（86.63% vs 57.47%），更好地保留了线粒体活性、细胞骨架结构和胚胎发育潜力。相关内容以 "Magnetic Hydrogel Encapsulation Combined with On-chip Processing Enhances Straw Vitrification of Mouse Oocytes" 发表在 《Biomaterials》！

图片解析

图1. 磁控水凝胶微胶囊封装和微流控芯片结构示意图： (a) 封装卵母细胞的磁控水凝胶微胶囊制备流程。(b) 微流控芯片三层堆叠结构分解图。(c) 芯片内部灌注室布局示意图及微胶囊加入捕获区域的明场显微图像。(d) 完整流程包括CPAs加载、玻璃化、复温和卵母细胞回收。

图2. 磁性海藻酸盐微胶囊的制备与表征： (a) 不同海藻酸钠浓度下卵母细胞受力示意图及光学图像，红色箭头指示机械损伤。(b) 含不同浓度磁珠的前驱体溶液照片。(c) 不同磁珠浓度和离心转速下微胶囊的尺寸分布和形貌。(d) 不同磁珠浓度水凝胶内部多孔结构的SEM图像。(e) 不同磁珠浓度水凝胶在PBS中的溶胀比。(f) 不同磁珠浓度水凝胶的拉伸应力-应变曲线。(g) 不同磁珠浓度水凝胶的杨氏模量。

图3. 微胶囊的磁响应性、冷冻保护评价和封装性能： (a) 无（左）和有（右）外部磁场时磁控微胶囊的聚集行为。(b) 外部磁场引导下培养皿中微胶囊的定向运动。(c) 单微胶囊在外部磁场下运动的轨迹追踪。(d) 不同磁珠浓度微胶囊迁移速度的定量分析。(e) 冷冻保存前（W/O）和后（W/）微胶囊形态的明场图像。(f) 冷冻保存前（W/O）和后（W/）微胶囊的SEM图像，箭头指示嵌入的磁珠。(g) 降温和复温过程中不同磁珠浓度微胶囊内冰晶形成的显微成像。(h) 不同磁珠浓度下封装卵母细胞的光学显微图像。(i) 有（W/ MBs）和无（WO/ MBs）磁珠组封装质量的视觉评估。(j) 卵母细胞封装率的定量分析。

图4. 微流控通道中流体混合和浓度分布的模拟与实验验证： (a) 通道内两种溶液浓度分布随时间变化的模拟结果。(b) 细胞捕获区域局部模拟结果。(c) 通道入口和出口位置的荧光图像及对应的相对荧光强度分布。(d) 通道入口和出口位置的X方向平均相对荧光强度分布。(e) 沿通道荧光强度的定量分析。(f) OC₁和OC₂之间浓度扩散随时间差异。(g) 不同流速比条件下的荧光溶液混合情况。

图5. 不同CPAs加载策略对卵母细胞体积响应的影响： (a) 定制微流控芯片CPAs加载示意图。(b) 阶跃加载和线性加载的CPAs浓度变化曲线。(c) 阶跃加载下未封装和封装卵母细胞的体积变化。(d) 微流控线性加载下磁封装卵母细胞的体积变化。(e) 三种条件下卵母细胞归一化体积变化曲线。(f) 三种条件下卵母细胞最小体积的定量比较。

图6. 不同组别卵母细胞冷冻保存效果比较： (a) 解交联前封装卵母细胞的活/死染色。(b) 解交联后各组（CV、Encap、Chip）卵母细胞的活/死染色。(c) 活卵和死卵的形态。(d) 卵母细胞存活率定量分析。(e) 不同磁珠浓度下玻璃化后卵母细胞存活率。

图7. 玻璃化-复温后卵母细胞线粒体功能和氧化还原状态评估： (a) JC-1染色评估MMP的代表性图像。(b) DCFH-DA染色检测ROS水平的代表性图像。(c) Fluo-4 AM染色检测胞内Ca²⁺水平的代表性图像。(d-f) MMP、ROS和胞内Ca²⁺荧光强度的定量分析。

图8. 冷冻保存后卵母细胞纺锤体形态和发育潜力评估： (a) 纺锤体（绿色）和染色体（蓝色）的免疫荧光图像。(b) 各组具有正常纺锤体形态的卵母细胞比例。(c) 卵母细胞发育的代表性图像。(d) 各组卵母细胞受精率和卵裂率的统计分析。

结论

本研究提出了一种将微流控技术与磁控水凝胶微胶囊相结合的新颖策略，旨在优化卵母细胞冷冻保存的流程和效率。定制设计的微流控芯片实现了CPAs的温和加载，最大程度地减少了渗透损伤。同时，磁控水凝胶微封装不仅为卵母细胞提供了抵御冰晶损伤的物理屏障，还通过磁控实现了卵母细胞在微通道内的精确捕获和定位。这两种技术的协同效应显著提高了复温后卵母细胞的存活率，有效维持了其功能完整性，保障了其发育潜力。在技术层面，磁操控与开闭式微流控芯片的结合极大地简化了操作流程和芯片结构，克服了传统CPAs加载过程中的实际困难，形成了一种高度可控且易于实施的方法。与当前临床玻璃化标准相比，该方法在存活率上相当，其独特优势在于更好地维护了卵母细胞的生理完整性和后续发育能力，为卵母细胞冷冻保存提供了具有显著转化潜力的新方案。