聚焦阿尔茨海默：中药自组装如何成为大脑的新“守护者”？郑州大学揭秘——姜黄素纳米颗粒脂质体调节小胶质细胞极化以治疗阿尔茨海默病

阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）是一种复杂且难以治愈的神经退行性疾病，其特征性病理改变之一是小胶质细胞激活诱导的神经炎症。近年来，随着对 AD 病理机制的深入研究，调节小胶质细胞极化从促炎的 M1 表型向抗炎的 M2 表型转变被认为是一种极具潜力的治疗策略。然而，由于 Aβ 蛋白聚集与小胶质细胞功能失调之间存在异常的相互作用，仅干预小胶质细胞的炎症相关通路难以实现高效的极化转变。因此，如何通过综合手段有效调节小胶质细胞极化，成为当前 AD 治疗研究的热点和难点。

姜黄具有活血化瘀、行气止痛的功效。姜黄素是从姜科植物姜黄的根茎中提取的天然多酚类化合物，是姜黄的主要活性成分。

近期，一项创新性研究提出了一种基于鼻腔给药的姜黄素纳米药物脂质体（RCLs@CNPs），通过高效调节小胶质细胞极化，为 AD 治疗提供了新的思路和方法。该研究深入探讨了 RCLs@CNPs 在体内外的药效机制，并在 AD 转基因小鼠模型中验证了其显著的治疗效果，为临床应用奠定了坚实的基础。

图1 论文首页

RCLs@CNPs 的制备与表征

研究人员采用绿色重沉淀法制备了 CNPs。将姜黄素溶解于乙醇中，快速滴入水中，在溶剂交换过程中，姜黄素分子通过分子间相互作用（如疏水相互作用）自组装形成 CNPs。X 射线衍射（XRD）分析显示，姜黄素的特征衍射峰在 CNPs 中消失或减弱，表明姜黄素从晶态转变为无定形的 CNPs。CNPs 呈现出良好的单分散性，粒径约为 53 nm，表面电位为 -37.8 mV，且在水溶液中分散性良好，有助于提高其生物利用度和药效。

进一步，研究人员通过薄膜分散法制备了 RCLs，并将 CNPs 装载其中形成 RCLs@CNPs。透射电子显微镜（TEM）观察到 RCLs@CNPs 的粒径约为 70 nm，略大于 CNPs，且其表面电位为 -12.3 mV，与 RCLs 接近，表明 CNPs 成功装载于 RCLs 中。在 AD 氧化微环境模拟条件下（含 H₂O₂ 的 PBS 中），RCLs@CNPs 能够响应性地分解，释放出 CNPs 和心磷脂，且在 7 天内保持良好的分散性和稳定性，为后续的药效发挥提供了保障。

图2 RCLs@CNPs的表征

RCLs@CNPs 对 Aβ 聚集的抑制效果

Aβ 聚集形成的纤维结构是诱导 M1 型小胶质细胞激活的关键因素，也是阻碍 M2 型极化的“路障”。研究人员通过透射电子显微镜（TEM）观察到，在含 H₂O₂ 的 PBS 中孵育 7 天后，Aβ 单体聚集形成了大量纤维。而 Cur、CNPs、RCLs@C 和 RCLs@CNPs 均能在不同程度上抑制 Aβ 纤维的形成，其中 CNPs 和 RCLs@CNPs 对 Aβ 纤维长度的缩短效果最为显著，分别为 405 ± 39 nm 和 381 ± 52 nm，远小于 Cur 和 RCLs@C 处理组的 757 ± 36 nm 和 732 ± 48 nm。此外，研究人员还利用 Thioflavin T（ThT）荧光法评估了 Aβ 聚集的动力学过程。结果表明，与 Aβ 单独孵育组相比，Cur、CNPs、RCLs@C 和 RCLs@CNPs 均显著降低了 ThT 荧光强度，且 CNPs 和 RCLs@CNPs 组的抑制效果相当，进一步证实了 RCLs@CNPs 在 AD 氧化微环境中能够有效释放 CNPs，发挥对 Aβ 聚集的抑制作用。

为了深入探究 CNPs 相较于 Cur 对 Aβ 聚集抑制效果更强的机制，研究人员进行了 10 ns 的分子动力学模拟。模拟结果显示，Cur 分子与 Aβ 单体之间主要通过疏水相互作用以及 Cur 分子的酚羟基与 Aβ 链上的谷氨酸（Glu11）形成的氢键发生单价相互作用，这种相互作用对 Aβ 聚集的抑制效果有限。而 CNPs 由于其较大的比表面积，能够与 Aβ 提供多个结合位点，发生多价相互作用，严重破坏了 Aβ 的 β-折叠结构，从而显著抑制了 Aβ 的聚集。通过计算平均势能，研究人员发现 CNPs 组的范德华力为 -348.77 kJ/mol，远低于 Cur 组的 -95.42 kJ/mol，且 CNPs 组的平均静电能绝对值和平均氢键数量均高于 Cur 组，进一步证实了 CNPs 与 Aβ 之间的多价相互作用强度高于 Cur 与 Aβ 之间的单价相互作用。这些结果表明，RCLs@CNPs 通过在细胞外有效抑制 Aβ 聚集，消除了小胶质细胞向 M2 表型极化的“路障”。

图3 β 淀粉样蛋白（Aβ）聚集抑制作用

RCLs@CNPs 对小胶质细胞极化的调节作用

研究人员首先评估了 RCLs@CNPs 对细胞活性的影响，结果显示其对神经样大鼠嗜铬细胞瘤（PC12）细胞和小鼠小胶质细胞（BV-2）均无明显毒性，表现出良好的生物相容性。进一步研究发现，与单独的 Aβ 处理组相比，Cur、CNPs、RCLs@C 和 RCLs@CNPs 均能促进 BV-2 小胶质细胞对 FITC 标记的 Aβ 的吞噬和清除，且 RCLs@CNPs 组的效果最为显著，表现为 Aβ 与溶酶体的共定位增加，这有助于消除 Aβ 聚集物对小胶质细胞极化的负面影响。

在小胶质细胞表型方面，Aβ 刺激的 BV-2 小胶质细胞表现出 M1 标志物（CD86、iNOS、TNF-α）的高表达，而 Cur、CNPs、RCLs@C 和 RCLs@CNPs 均能降低 CD86 的表达，同时增加 M2 标志物（CD206 和 Arg-1）的表达，表明这些处理能够促进小胶质细胞从 M1 表型向 M2 表型极化。通过西方印迹法检测 TLR4 和 NF-κB 的表达水平发现，Aβ 处理组的 TLR4 和 NF-κB 表达水平分别是 PBS 组的 3.5 倍和 2.6 倍，而 RCLs@CNPs 处理组的 TLR4 和 NF-κB 表达水平接近 PBS 组，显著抑制了 TLR4/NF-κB 信号通路的激活。这表明 CNPs 通过多价结合抑制 Aβ 聚集，减轻了 M1 型小胶质细胞的激活，而姜黄素本身具有抑制 TLR4/NF-κB 信号通路的作用，同时 RCLs 中的心磷脂作为一种信号分子，能够减少激活的小胶质细胞分泌促炎因子。因此，RCLs@CNPs 能够高效地调节小胶质细胞从 M1 表型向 M2 表型极化，从而重塑大脑微环境，保护神经元。

图4 RCLs@CNPs 缓解了小胶质细胞对 β 淀粉样蛋白（Aβ）的吞噬功能障碍，调节了小胶质细胞向 M2 型极化

RCLs@CNPs 对神经炎症的抑制作用及神经保护效果

研究人员利用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测了不同表型小胶质细胞分泌的细胞因子水平。结果显示，Aβ 刺激的 M1 型小胶质细胞分泌高水平的促炎因子 TNF-α 和 IL-6，而 RCLs@CNPs 处理后，小胶质细胞的表型从 M1 转变为 M2，分泌抗炎因子（IL-4）和脑源性神经营养因子（BDNF），这些因子有助于神经元的保护、修复和再生。进一步，研究人员构建了基于 Transwell 的小胶质细胞 - 神经元共培养模型，评估小胶质细胞与神经元之间的相互作用。结果表明，与 Aβ 共培养的小胶质细胞加剧了神经元的损伤，而 RCLs@CNPs 处理的小胶质细胞能够恢复神经元的活力，保护神经元免受损伤。

此外，研究人员还发现，Aβ 聚集物不仅激活小胶质细胞，还会直接攻击神经元，导致细胞死亡。通过流式细胞仪检测发现，Aβ 处理组中约 33.8% 的 PC12 神经元发生凋亡，而 RCLs@CNPs 处理后，凋亡细胞比例显著降低至 10%。这表明 RCLs@CNPs 通过抑制 Aβ 聚集，减轻了 Aβ 诱导的神经毒性，保护了神经元。

图5 RCLs@CNPs 抑制了神经炎症，起到了神经保护的作用

RCLs@CNPs 的体内治疗效果

在体内实验中，研究人员首先通过荧光成像技术比较了 RCLs@CNPs 经静脉注射和鼻腔给药后的脑靶向效率。结果表明，鼻腔给药后，标记有花青素 5（Cyanine5, Cy5）的 RCLs@CNPs 在脑组织中的荧光信号强度比静脉注射组增加了 1.6 倍，这表明鼻腔给药能够有效绕过血脑屏障，通过嗅神经和三叉神经将药物递送至大脑，为中枢神经系统疾病的治疗提供了一种非侵入性的给药途径。

随后，研究人员在 APP/PS1 转基因小鼠模型中评估了 RCLs@CNPs 的抗 AD 治疗效果。这些小鼠表现出与 AD 相关的临床症状，如记忆和学习障碍。经过一个月的鼻腔给药治疗后，研究人员通过 Morris 水迷宫（Morris Water Maze, MWM）和筑巢实验对小鼠的行为进行了测试。在 MWM 测试中，与生理盐水处理组相比，RCLs@CNPs 处理组的小鼠显著缩短了逃避潜伏期，且在移除逃避平台后的测试中，RCLs@CNPs 组的小鼠在目标象限停留的时间最长，穿越逃避平台的次数最多，表明其记忆和学习障碍得到了显著改善。在筑巢实验中，APP/PS1 小鼠由于认知障碍无法建造完整的巢，而经过 Cur、CNPs、RCLs@C 和 RCLs@CNPs 处理的小鼠筑巢能力得到不同程度的恢复，其中 RCLs@CNPs 处理的小鼠表现出最佳的筑巢技能，进一步证实了 RCLs@CNPs 对神经精神症状的显著改善效果。

在病理变化方面，研究人员观察到，经过生理盐水处理的小鼠大脑中有大量 Aβ 斑块沉积，而 RCLs@CNPs 处理后，Aβ 沉积显著减少，这证实了 RCLs@CNPs 能够有效抑制 Aβ 聚集并促进 Aβ 清除。免疫荧光图像显示，Aβ 负荷（绿色）招募了激活的小胶质细胞（红色），而 RCLs@CNPs 处理显著减少了斑块面积。此外，与生理盐水组相比，RCLs@CNPs 处理组小鼠海马区的炎症因子（TNF-α 和 iNOS）和活性氧（ROS）表达降低，而抗炎标志物 Arg-1 的表达增加，这表明 RCLs@CNPs 通过促进小胶质细胞从 M1 表型向 M2 表型极化，重塑了抗炎的大脑环境，从而保护了神经元。尼氏染色结果显示，野生型小鼠的神经元轮廓清晰，细胞质中存在大量的尼氏体。然而，AD 小鼠的尼氏体发生了显著的染色质溶解。幸运的是，RCLs@CNPs 治疗恢复了尼氏体的数量，并改善了神经元的完整性。RCLs@CNPs 治疗后尼氏体数量的减少表明了其神经保护作用。此外，研究人员还调查了海马区的突触后标记物（突触后密度 - 95，PSD - 95）和突触前标记物（突触素，SYN）。结果显示，APP/PS1 小鼠中 PSD - 95 和 SYN 的共聚体明显减少，表明突触减少。然而，RCLs@CNPs 治疗恢复了 PSD - 95 和 SYN 的表达。这些结果表明，RCLs@CNPs 减少了 Aβ 对突触的毒性作用，改善了突触可塑性。苏木精 - 伊红（HE）染色的组织显示，在治疗后的主要组织中没有明显的组织病理学病变，表明 RCLs@CNPs 的生物安全性。

图6 RCLs@CNPs 在体内的治疗效果

小结

本研究成功开发了一种基于鼻腔给药的姜黄素纳米药物脂质体（RCLs@CNPs），通过高效调节小胶质细胞极化，为 AD 治疗提供了一种新的策略。

参考文献：

Feng Q, Zhang X, Zhao X, Liu J, Wang Q, Yao Y, Xiao H, Zhu Y, Zhang W, Wang L. Intranasal Delivery of Pure Nanodrug Loaded Liposomes for Alzheimer's Disease Treatment by Efficiently Regulating Microglial Polarization. Small. 2024 Dec;20(50):e2405781. doi: 10.1002/smll.202405781. Epub 2024 Oct 6. PMID: 39370581..