一线阿替利珠单抗联合化疗治疗广泛期小细胞肺癌，检测基线血浆cfDNA浓度、变异丰度等是否可预测疾病死亡风险？

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阿替利珠单抗（A）联合卡铂-依托泊苷（CE）是广泛期（ES）小细胞肺癌（SCLC）患者的新一线治疗方案。本研究旨在探究接受ACE方案治疗的SCLC患者中，cfDNA、肿瘤分数（TF）和肿瘤相关突变的变异等位基因频率（VAF）的基线水平及动态变化与中位（m）总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）的相关性。本研究为单中心前瞻性探索性研究，纳入初治且符合一线ACE方案治疗指征的ES-SCLC患者。分别于基线（T0）、第1周期治疗后（T1）、第2周期治疗后（T2）和疾病进展时（T3）纵向采集液体活检样本；对cfDNA进行下一代测序（NGS）分析，并通过低深度全基因组测序（sWGS）推导基因组图谱和TF。

本研究共纳入32例患者，mPFS为5.19个月，mOS为7.96个月。较高的T0 cfDNA（HR 1.44, 95% CI 1.17-1.77, p = 0.0006）和VAF（HR 2.6, 95% CI 1.36-4.93, p = 0.0039）与死亡风险相关；较高的T0 cfDNA（HR 1.29, 95% CI 1.08-1.54, p = 0.0049）、TF（HR 1.97, 95% CI 1.02-3.82, p = 0.044）和VAF（HR 2.32, 95% CI 1.22-4.42, p = 0.01）是PD风险的预测因子。在所研究的生物标志物的动态变化中，评估的VAF T0-T1和T0-T2升高10个单位与OS（HR 1.38, 95% CI 1.01-1.88, p = 0.043; HR 1.56, 95% CI 1.21-2.16, p = 0.008）和PFS（HR 1.69, 95% CI 1.18-2.43, p = 0.004; HR 1.81, 95% CI 1.22-2.70, p = 0.003）相关。

cfDNA、TF和VAF的基线水平及动态变化有助于临床医生对接受一线ACE方案治疗的ES-SCLC患者进行风险分层，并预测疾病的临床病程。

研究背景

小细胞肺癌（SCLC）是一种高级别神经内分泌肿瘤，约占肺癌患者的15%。确诊时，约70%的SCLC患者表现为广泛期（ES）病变，其特征为肿瘤表型具有侵袭性，患者预后极差。铂类为基础的化疗多年来一直是临床标准治疗方案，尽管患者初始对治疗的应答率较高，但敏感性具有暂时性，中位无进展生存期（PFS）仅为5-6个月，中位总生存期（OS）为9-10个月。近年来，免疫检查点抑制剂联合铂类为基础的化疗成为ES-SCLC患者的新一线治疗方案。在IMpower133试验中，铂类为基础的化疗联合阿替利珠单抗治疗4个周期后序贯阿替利珠单抗维持治疗，将患者的mOS从单纯化疗的10.3个月延长至12.3个月（风险比HR=0.70，95%置信区间CI：0.54-0.91）。与之相似，CASPIAN试验证实，铂类为基础的化疗联合度伐利尤单抗同样能使患者获益，mOS从单纯化疗的10.5个月提升至12.9个月（HR=0.71，95%CI：0.60-0.86）。

尽管上述研究数据令人振奋，但铂类为基础的化疗联合免疫治疗带来的长期获益仍未满足临床需求，在IMpower133/IMbrella A试验中，仅有12%（95%CI：7%-17%）的患者存活至5年。

此外，部分患者无法从免疫治疗联合化疗中获益。在此背景下，科研人员开展了大量研究，探索能够预测患者预后、协助临床医生筛选适宜治疗人群的潜在新型生物标志物。然而，由于SCLC的侵袭性特征，往往难以获取足量且连续的组织标本开展深入研究，因此寻找SCLC的新型生物标志物存在一定挑战性。

此外，免疫治疗应答的经典预测因素，如程序性死亡配体1（PD-L1）和肿瘤突变负荷（TMB），在SCLC患者的风险分层中似乎未发挥显著作用。相反，近期研究发现，基因表达谱（GEP）和肿瘤微环境（TME）特征有助于识别能够从免疫治疗中获益的患者，本研究团队也对此展开了相关探索。

为解决组织标本缺乏的问题，液体活检技术在过去几年中得到了飞速发展，目前已成为一种可靠、易获取且无创的检测手段，适用于多种临床场景。液体活检的另一显著优势是能够捕捉肿瘤的异质性，且可用于纵向研究。在该研究场景中，连续采集的血液样本能够捕捉SCLC的可塑性和动态变化，从而提供循环肿瘤DNA（ctDNA）的定性和定量数据。但迄今为止，关于液体活检在SCLC中预测价值的相关数据仍较为有限。

基于上述前提，本研究团队设计并开展了CATS/ML43257前瞻性研究，旨在通过纵向液体活检，筛选出能够预测ES-SCLC患者对化学免疫治疗应答的循环生物标志物，为患者风险分层和预测免疫治疗长期获益提供潜在参考依据。

研究方法

于关键时间点纵向采集液体活检样本：T0（基线评估，对应首个治疗周期的第1天）、T1（首个治疗周期后，对应第二个治疗周期的第1天）、T2（第二个治疗周期后，对应第三个治疗周期的第1天）和T3（疾病进展时）。每次采集时，从每位患者外周静脉采集约20 mL血液，置于两支游离DNA采血管中，并在24-72小时内完成样本处理。

图1

研究结果

患者特征：

2021年10月至2024年3月，共有33例患者纳入CATS/ML43257研究，1例患者因临床状况快速恶化并早期接受最佳支持治疗、未接受化学免疫治疗，最终被排除在数据分析之外。表1总结了32例符合入组标准患者的临床特征：患者以男性为主（19例，59.4%），东部肿瘤协作组体能状态评分（ECOG PS）0或1分者28例（87.5%），中位年龄65岁；所有患者均有吸烟史（现吸烟或既往吸烟），中位吸烟量为40包/年；22例（68.8%）患者的转移部位少于3个，7例（21.9%）患者确诊时存在经治疗和/或临床稳定的脑转移；基线时合并肝转移的患者6例（18.8%），合并骨转移的患者13例（40.6%）。

表1

15例（47%）患者此前接受过肿瘤组织基因表达谱检测，其中10例为炎症型（三阴性，I型），3例为ASCL1阳性型（A型），2例为神经内分泌型（NEUROD1阳性，N型）。

患者的中位诱导治疗周期数为4个（1-6个），中位维持治疗周期数为3个（0-43个）。中位随访时间为20个月（95%CI：19.0-未达到），意向治疗（ITT）人群的客观缓解率为75%，疾病控制率为84.4%；中位PFS为5.19个月（95%CI：4.74-6.55），中位OS为7.96个月（95%CI：6.91-14.64）。在分类临床特征中，性别（男性HR=2.44，95%CI：1.01-5.88，p=0.047）和转移部位数量（≥3个HR=2.90，95%CI：1.18-7.09，p=0.020）与OS显著相关，且转移部位数量也与PFS显著相关（≥3个HR=3.44，95%CI：1.44-8.23，p=0.005）（表2）。

表2

炎症型表型与神经内分泌型联合ASCL1阳性表型患者的基线cfDNA（p=0.12）、TF（p=0.18）和VAF（p=0.14）水平均无显著差异，这可能与本研究样本量较小有关。

cfDNA分析：

本研究于T0和T1时间点各采集32份样本，T2时间点采集31份样本（减少原因为1例患者死亡），T3时间点采集21份样本。具体而言，在数据截止日期（2024年10月31日），6例患者在T3样本采集前死亡，5例患者尚未出现疾病进展。本研究在各时间点共采集116份血浆样本，均成功提取cfDNA。确诊时（T0），cfDNA中位水平为24.9 ng/mL血浆，范围为3.7-704.3 ng/mL血浆。

将基线cfDNA作为连续变量（范围为10.16 ng/mL（Q1）至86.86 ng/mL（Q3）），分析其与PFS和OS的相关性，结果显示：较高的基线cfDNA水平与疾病进展（HR=1.29，95%CI：1.08-1.54，p=0.0049）和死亡风险增加（HR=1.44，95%CI：1.17-1.77，p=0.0006）均显著相关（图2）。

图2

此外，T0至T1期间cfDNA水平显著降低（中位数24.9 ng/mL，四分位距10.2-86.9 ng/mL vs 中位数19.1 ng/mL，四分位距11.3-31.9 ng/mL；p=0.03），T0至T2期间cfDNA水平也显著降低（中位数24.9 ng/mL，四分位距10.2-86.9 ng/mL vs 中位数14.2 ng/mL，四分位距9.9-28.8 ng/mL；p=0.03）；疾病进展时（T3），cfDNA水平较T2显著升高（中位数14.2 ng/mL，四分位距9.9-28.8 ng/mL vs 中位数40.5 ng/mL，四分位距12.5-59.3 ng/mL；p=0.01），部分患者的cfDNA水平甚至恢复至基线水平（图3a）。cfDNA水平在不同时间点的升高与PFS无显著相关性，而T0-T2期间cfDNA变化值增加10个单位，患者的死亡风险更高（HR=1.17，95%CI：1.04-1.32，p=0.009）。

图3

肿瘤相关突变特征分析：

T0时间点，32例患者中有31例（96.8%）检测到肿瘤相关突变，其中19例（61.2%）患者存在2个及以上致病性或可能致病性基因变异。TP53和RB1是最常见的突变基因，具体而言，23例（74%）患者存在TP53突变，17例（54.8%）患者存在RB1突变；TP53突变主要为DNA结合域的错义突变，而RB1突变主要为无义突变。其他常见突变基因包括PTEN（9.3%）、PIK3CA（9.3%）和KRAS（6.2%）。各突变基因的具体VAF见图4。本研究以VAF最高的基因为指标，评估治疗期间的突变清除情况（VAF降低99%-100%）：T0至T1期间，12例（38.7%）患者出现VAF清除；T0至T2期间，21例（67.7%）患者出现VAF清除。相反，疾病进展时（T3），16例（50%）患者的肿瘤相关突变VAF升高，且恢复至接近基线水平；此外，8例（25%）患者出现新的致病性突变，且所有新突变的VAF均<10%（表3）。同时，疾病进展时出现新致病性突变的患者与确诊时检测到突变的患者，其中位PFS和OS均无显著差异。

图4

表3

将基线VAF作为连续变量（范围为8.33%（Q1）至49.08%（Q3）），分析其与临床结局的相关性，结果显示：基线VAF较高与疾病进展风险增加（HR=2.32，95%CI：1.22-4.42，p=0.01）和死亡风险增加（HR=2.59，95%CI：1.36-4.93，p=0.0039）均显著相关（图2）。

通过纵向分析观察VAF的动态变化趋势：T0、T1、T2、T3时间点的VAF中位数分别为27.0%（四分位距8.3%-49.1%）、0.9%（四分位距0-6.0%）、0.2%（四分位距0-1.6%）和46.8%（四分位距12.3%-55.0%）。T0至T1期间（p=0.0002）和T0至T2期间（p=0.0001），VAF均出现统计学意义上的显著清除；相反，T1至T3期间（p=0.0004）和T2至T3期间（p=0.0002），VAF均出现统计学意义上的显著升高（图3b）。

T0-T1期间VAF变化值增加10个单位，患者的疾病进展风险较高（HR=1.69，95%CI：1.18-2.43，p=0.004）；T0-T2期间VAF变化值增加10个单位，疾病进展风险同样较高（HR=1.81，95%CI：1.22-2.70，p=0.003）。T0-T1期间VAF变化值增加10个单位，患者的死亡风险较高（HR=1.38，95%CI：1.01-1.88，p=0.043）；T0-T2期间VAF变化值增加10个单位，死亡风险也较高（HR=1.56，95%CI：1.21-2.16，p=0.008）。

sWGS分析TF和基因组图谱特征：

sWGS结果显示，基线（T0）和疾病进展时（T3），大多数患者的基因组图谱存在变异且TF阳性（TF≥3%）：具体而言，T0时间点32份样本中有27份（84.4%）TF阳性，T3时间点21份样本中有19份（90.5%）TF阳性；在中期时间点T1和T2，基因组图谱变异且TF阳性的样本分别为32份中的13份（40.6%）和31份中的7份（22.6%）。

T0时间点TF中位数为29.8%（四分位距12.5%-48%）；T1和T2时间点TF中位数均降至0.0%（T1四分位距0.0%-11.6%，T2四分位距0.0%-0.0%）；T3时间点TF中位数回升至33.6%（四分位距14.5%-51.6%）（图3c）。

T3时间点仅2例患者（CATS 16和CATS 31）的TF为阴性。

将基线TF作为连续变量（范围为12.46%（Q1）至48.02%（Q3）），分析其与临床结局的相关性，结果显示：基线TF较高是疾病进展风险增加的预测因素（HR=1.97，95%CI：1.02-3.82，p=0.044）（图2）。

在T0时间点TF阳性的27例患者中，观察到两种不同的变化模式：第一组20例患者（20/27，74%）的基因组图谱恢复正常，且T2时间点TF完全清除（TF降低100%）；相反，第二组7例患者（7/27，26%）的基因组图谱仍存在异常，且T2时间点TF未完全清除，TF降低幅度为3.3%-81.2%，其中1例患者（CATS 9）的TF甚至出现升高（图3）。

第一组患者T0时间点TF中位数为32.39%（Q1-Q3：20.2%-47.8%）；T1和T2时间点TF均显著降至0.00%（T1 Q1-Q3：0.00%-1.3%，T2中位数0.00%）；疾病进展时（T3），TF中位数回升至25.41%（Q1-Q3：14.5%-51.3%），且除2例患者（CATS 16和CATS 31）外，其余患者的TF均在T3时间点再次升高。

第二组患者T0时间点TF中位数为48.97%（Q1-Q3：29.4%-56.9%）；T1时间点，6例患者（CATS 2、CATS 8、CATS 11、CATS 23、CATS 27、CATS 32）的TF轻度降低，降幅为6.42%-68.37%，1例患者（CATS 9）的TF升高29.76%，该时间点TF中位数为28.11%（Q1-Q3：19%-44.2%）；T2时间点，5例患者（CATS 2、CATS 9、CATS 11、CATS 23、CATS 32）的TF降低3.21%-43.05%，其余2例患者的TF升高0.29%-20%，该时间点TF中位数为23.66%（Q1-Q3：17.9%-38.3%）；T3时间点，该组所有患者的TF均升高，中位数为52.96%（Q1-Q3：41.8%-63.2%）。

T2时间点TF完全清除的第一组20例患者，其PFS显著长于TF未完全清除的第二组7例患者（p=0.0009）。

此外，第三组为5例患者（CATS 12、CATS 19、CATS 30、CATS 31、CATS 33），其T0时间点TF为0.00%且基因组图谱正常；除CATS 19患者T1时间点TF为5.36%外，其余患者T1和T2时间点的TF均持续为阴性；该组样本量较小，仅2例患者（CATS 30和CATS 31）有T3时间点的样本，其TF值分别为12.97%和0.00%。

T0-T1期间TF变化值增加10个单位，患者的疾病进展风险更高（HR=1.49，95%CI：1.10-2.01，p=0.01）；T0-T2期间TF变化值增加10个单位，疾病进展风险同样更高（HR=1.86，95%CI：1.25-2.75，p=0.002）。T0-T2期间TF变化值增加10个单位，患者的死亡风险更高（HR=1.56，95%CI：1.09-2.21，p=0.014）。

最后，为探索研究目的，本研究纳入所有协变量构建随机森林算法，结果显示：基线cfDNA、VAF和转移部位数量是预测OS和PFS的重要指标（图5）。

图5

讨 论

SCLC的生物学特征为肿瘤异质性高、可塑性强，这也是其具有临床侵袭性且现有全身治疗方案预后不佳的原因。尽管临床已引入新的一线标准治疗方案，但仅有一小部分患者能从化学免疫治疗中获得长期获益，且从临床角度难以识别这部分人群。本研究纳入的真实世界队列患者，其中位无进展生存期和总生存期均较低，这一结果证实了上述研究结论，且与临床试验的现有文献数据一致。

近期，基于SCLC肿瘤样本的转录组学分析将其分为4种不同亚型，其特征为对 ASCL1（A）、NEUROD1（N）、POU2F3（P）转录因子标志物的阳性表达，或者这三种标志物的缺失或低表达，并且与炎症基因表达标志（SCLC-I）相关联。尽管现有数据显示，不同亚型患者从化学免疫治疗中获得的获益存在差异，但该分型方法目前尚未应用于临床实践。

在此临床背景下，由于肿瘤组织标本稀缺且疾病呈动态进展，寻找组织源性预测生物标志物的难度较大；而液体活检具有重要价值，且有研究证实，与非小细胞肺癌（NSCLC）和其他肿瘤类型的血浆样本相比，SCLC患者的ctDNA浓度更高，提示SCLC是一种肿瘤DNA释放量较高的癌症。肿瘤DNA的释放量由癌症类型以及转移部位的数量、位置等其他生物学和临床特征决定。

与既往研究结果一致，本研究队列中cfDNA的中位浓度为24.9 ng/mL血浆（范围3.7-704.3 ng/mL血浆），TF的中位数为29.8%（四分位距12.5%-48%）；而在NSCLC中，仅有20%的患者TF超过10%。这些数据进一步证实，液体活检可有效检测并监测SCLC全身治疗期间的cfDNA水平。已有多项研究报道cfDNA在癌症中的预后价值，本研究数据在SCLC中也证实了这一点，发现cfDNA浓度升高与死亡风险增加相关（p=0.0006），且T0-T2期间cfDNA变化值增加10个单位，患者的死亡风险更高（p=0.009），这可能与cfDNA水平与转移部位数量直接相关有关。此外，本研究还发现cfDNA水平与患者对一线化疗免疫治疗的疾病进展风险相关。

SCLC释放ctDNA的特性，使得通过sWGS成功检测TF成为可能，该方法是目前领域内定量血浆样本中癌症源性cfDNA比例的成熟方法。

本研究发现，基线TF升高以及T0-T1、T0-T2期间TF水平增加10个单位，均与疾病进展风险较高相关（p=0.044、p=0.01、p=0.002）；而T0-T2期间TF水平增加10个单位，与死亡风险较高相关（p=0.014）。值得注意的是，本研究队列中T2时间点的TF清除与PFS改善相关（p=0.0009）。这些研究结果与既往不同癌症类型的研究结论一致，提示基线TF及其动态变化可作为预后和预测生物标志物。

值得注意的是，本研究中有5例患者的基线血浆样本中未检测到TF，且其cfDNA浓度低于队列中其他患者（中位数9.3 ng/mL血浆 vs 28.95 ng/mL血浆）；但通过Avenio NGS检测，在这些患者中检测到了体细胞点突变，VAF范围为0.21%-2.6%，该VAF值低于TF计算算法的检测限（要求TF至少为3%），证实这些血浆样本中的ctDNA水平较低。结合该亚组患者TF无法检测、血浆cfDNA产量低且驱动突变VAF低的特征，本研究将其定义为ctDNA低释放型患者。

对此，Husain等人开展的一项大型研究报道，SCLC患者液体活检的TF中位数为17.7%，且在115例患者中，12%的样本无法检测到TF。该研究结果与本研究结论一致，本研究32份样本中有5份（15.6%）无法检测到TF。TF水平低或无法检测的原因可能为ctDNA释放不足或检测方法的灵敏度有限。

值得注意的是，这5例SCLC患者的转移部位均少于3个，其中2例（40%）合并骨转移，1例（20%）合并脑转移，且基线时均无肝转移。由此可推测，TF阴性的SCLC可能具有独特的肿瘤生物学行为，其转移倾向较低；但由于缺乏组织标本，该假说无法进一步验证。

除了生物标志物静态水平的预后价值外，从临床角度来看，动态监测cfDNA的临床价值更具吸引力，因为其浓度随时间的变化可在治疗的前几个周期为临床提供参考，帮助医生在影像学检测发现疾病进展前做出早期预判。本研究采用限制性立方样条分析不同时间点cfDNA水平变化与生存结局的关系，发现其与对数风险比呈近似线性相关；这一结果支持本研究在生存分析中将cfDNA清除作为连续变量，而非人为设定临界值进行患者分层。

与其他研究场景一致，本研究发现T0至T1期间cfDNA水平显著降低（中位数24.9 ng/mL vs 19.1 ng/mL），T0至T2期间也显著降低（中位数24.9 ng/mL vs 14.2 ng/mL）；而T3时间点的cfDNA水平较T2显著升高（中位数14.2 ng/mL vs 40.5 ng/mL）。考虑到SCLC患者疾病进展迅速、临床状况恶化快，这些数据更具临床意义；在本研究队列中，11例患者（34%）因体能状态快速恶化并死亡，无法在T3时间点采集血液样本。

本研究队列中，2例患者在疾病进展时采集的血浆样本中未检测到TF：1例为ctDNA低释放型患者，所有时间点的TF均无法检测；另1例患者T0时间点的TF最初为阳性（12.8%），后续时间点降至0。这2例患者确诊时的转移部位均少于3个，分别为淋巴结和胸膜受累，无骨、脑或肝转移；T3时间点均出现全身性疾病进展，其中1例合并脑转移，1例合并淋巴结病变。

本研究发现，基线时TP53和RB1基因的突变频率较高，因此可在各治疗周期中对其进行监测；研究证实，二者的基线水平和动态变化值均与OS和PFS显著相关。本研究团队和其他研究团队的既往研究均强调了VAF检测的临床应用价值；与反复进行全基因组测序相比，识别少量特异性突变并将其作为癌症临床病程的监测指标，有望提高该检测手段的可及性并降低成本。有趣的是，本研究在3例患者中检测到PTEN突变，且仅1例患者的PTEN突变VAF为20%-50%；该患者在疾病进展时发生脑转移，这与既往研究结论一致，提示特定通路的变异可能与肿瘤进展模式相关。

最后，对SCLC患者液体活检中的基因突变进行动态监测，还能在疾病进展时识别获得性耐药突变，这为进一步研究免疫检查点抑制剂治疗后的耐药机制和特征提供了假说依据。本研究在1例患者中检测到APC基因的获得性突变，且VAF较高，该患者的临床病程具有侵袭性且早期死亡；但总体而言，复发型SCLC的基因组图谱与治疗前高度相似，提示其获得性耐药可能与非基因机制相关，不过本研究中NGS panel检测的基因数量有限，因此无法得出明确结论。

本研究的主要局限性为样本量较小，难以深入探讨部分生物学问题，例如循环生物标志物与组织基因组图谱及相应分子亚型的相关性；但本研究为探索性研究，前瞻性的研究设计和数据、样本采集方式，为后续在接受一线化疗免疫治疗的真实世界人群中开展多中心前瞻性验证研究，以及在随机临床试验中将cfDNA、TF和肿瘤相关VAF作为风险分层生物标志物用于强化治疗策略，奠定了基础。

cfDNA、TF和VAF的基线水平及动态变化，有助于临床医生对接受一线ACE方案治疗的ES-SCLC患者进行风险分层，并预测疾病的临床病程。在治疗全程监测这些生物标志物，不仅能为治疗应答提供有用参考，还能实现疾病进展的早期评估。具体而言，分析其随时间的变化可提高疾病临床病程的预测能力，助力制定更个性化的治疗决策，并可能改善治疗结局。

参考文献：

Pasello, G., Pigato, G., Scattolin, D. et al. Baseline levels and dynamic changes of cfDNA, tumor fraction and mutations to anticipate the clinical course of small cell lung cancer (SCLC) patients treated with first-line atezolizumab and chemotherapy: an hypothesis generating study (CATS/ML43257). J Exp Clin Cancer Res 44, 178 (2025). https://doi.org/10.1186/s13046-025-03434-3