Genome Biology：编码区的沉默突变影响丙型肝炎病毒RNA结构模式并减弱病毒复制和致病性

丙型肝炎病毒（HCV）感染是全球范围内一项严峻的公共卫生挑战，据估计全球有7100万人患有慢性HCV感染，每年导致约35万例肝脏相关死亡。尽管直接抗病毒药物能够实现超过95%的持续病毒学应答，治愈率较高，但约40%的感染者未被诊断，仅约7%的病例接受了治疗，即便在治愈后，肝细胞癌风险依然存在，因此开发有效的预防性HCV疫苗成为一项迫切且未满足的医疗需求。历史上，全球病毒感染的根除仅通过疫苗接种实现而非治疗，鉴于HCV感染在相当一部分个体中可自发清除，通过有效疫苗诱导成功的免疫反应是一个可实现的目标。HCV属于黄病毒科，具有正义单链RNA基因组，其RNA不仅编码蛋白质，还包含丰富的二级和三级结构，这些结构在病毒生命周期的多个环节中发挥关键作用，包括复制、翻译、包装、免疫逃逸以及劫持宿主细胞机制，病毒基因组中这些隐藏的调控元件，特别是在编码区内，可能代表了病毒控制多种过程的一种高效进化策略。

本研究开发并应用了一种新颖的计算生物学流程，用于识别HCV遗传密码中进化选择的“沉默”基因组模式，并利用这些模式进行病毒减毒设计，研究团队从ViPR数据库和NCBI GenBank下载了757株完整的HCV毒株序列，经过过滤重复和错误序列后，最终获得了699条完整注释序列，这些序列涵盖了HCV的1至6基因型，代表了全球96%至99%的流行毒株，研究聚焦于非结构蛋白5（NS5，包括NS5A和NS5B）的编码序列，因为NS5在抑制宿主先天免疫机制（NS5A）以及催化病毒RNA复制（NS5B）方面具有关键作用。基于这699条序列的多序列比对，研究人员采用了三种主要策略来理性设计减毒的HCV基因组变体，第一种策略（方法A）针对RNA二级结构，通过创建随机化的零分布并与实际序列的局部折叠能谱进行比较，识别出在进化上显著选择强折叠（低局部折叠能）或弱折叠（高局部折叠能）的基因组区域，随后使用模拟退火算法寻找能够削弱强折叠区域或增强弱折叠区域折叠强度的同义突变，最终设计了四个变体（HCVmut3-6）。第二种策略（方法B）关注低代表性序列，通过比较实际序列与两种零模型（同义密码子置换和同义二核苷酸置换），鉴定出在进化中被清除的5核苷酸序列，认为这些序列可能代表不利的调控元件，并通过同义突变在相应区域故意插入这些低代表性序列，从而设计了一个变体（HCVmut7）。第三种策略（方法C）基于序列保守性，利用香农熵评估每个基因组位置的进化保守程度，并对中度至高度保守的密码子位点进行同义突变，替换为在MSA对应列中频率较低但至少为10%的密码子，以此设计了三个变体（HCVmut1-2和HCVmut8）。

总体而言，研究团队共设计了八个在HCV NS5A/NS5B序列中包含同义突变的病毒变体，这些变体的序列经过化学合成后，克隆至pHJ3-5载体并体外转录为RNA，随后通过电穿孔导入FT3-7细胞以产生感染性病毒，并制备了病毒储备液，在后续研究中，由于HCVmut2和HCVmut8未能产生复制性基因组，这两个变体被排除在进一步研究之外，其余六个变体则用于后续的功能评估。为了评估这些同义突变对病毒适应性的影响，研究人员首先比较了野生型与突变型病毒的感染和传播能力，通过免疫荧光染色检测病毒蛋白，发现在感染后第2、4和6天，所有测试变体形成的感染灶大小均小于野生型病毒，其中HCVmut6和HCVmut7的细胞间传播能力最低，在感染百分比方面，野生型病毒在感染两周后即可达到100%的感染率，而HCVmut3和HCVmut5则需要四周才能达到相同水平，HCVmut6和HCVmut7在整个四周观察期内感染率均未显著提升，表明其复制和传播能力严重受损。

图1 研究概述及减毒合成RNA病毒理性设计计算流程示意图

为了进一步量化病毒复制水平，研究团队在感染后不同时间点通过qPCR检测了细胞内的HCV RNA水平，结果显示所有突变病毒的RNA复制水平均低于野生型，且不同变体的复制水平与其感染和传播能力的观察结果一致，HCVmut6和HCVmut7依然是复制最弱的变体，为了排除感染细胞百分比低对RNA水平测量的潜在影响，研究人员通过流式细胞分选技术分离出被感染细胞，并专门在这些细胞中检测HCV RNA，结果再次确认了突变病毒在感染细胞内的RNA水平确实低于野生型，从而证实了其复制能力的减弱并非由于感染效率低，而是病毒内在适应度下降所致。基于病毒在感染、传播和RNA水平这三项指标上的综合表现，研究团队选取了三个具有梯度减毒效果的变体进行后续深入研究，分别是HCVmut3（命名为“强”变体）、HCVmut4（“中”变体）和HCVmut7（“弱”变体），其病毒适应度排序为野生型 > “强” > “中” > “弱”。

病毒减毒疫苗的一个关键考量因素是遗传稳定性，即减毒病毒在传代过程中发生回复突变的风险，研究人员对含有78个插入突变的HCVmut7变体进行了深度测序分析，在感染两周后，发现仅有12个位置的核苷酸发生了改变，且所有这些改变均为同义突变并回复到了野生型序列，这些回复突变在病毒群体中的频率介于15%至21%之间，此外，在3'非翻译区检测到一个低频突变，但该位置并非原始设计突变位点，结合HCVmut7在长达四周的培养中仍维持低水平复制和传播的观察结果，表明该变体具有相对的遗传稳定性，大量插入的突变构成了较高的回复突变屏障。为了评估减毒变体对宿主细胞的致病性影响，研究团队对感染不同病毒（野生型、“强”、“中”、“弱”变体）的细胞进行了RNA测序和差异表达分析，结果显示，与未感染对照相比，野生型病毒感染引起了808个差异表达基因，而“强”变体仅引起170个，“中”和“弱”变体则未引起显著差异表达，在直接比较变异体感染与野生型感染的基因表达时，发现大多数基因在“中”和“弱”变体感染下的表达扰动程度小于野生型，而在“强”变体感染下，多数基因的表达扰动与野生型相似，但仍有部分基因受到抑制，通过qRT-PCR对特定癌症相关基因的表达验证进一步证实，野生型病毒能显著改变这些基因的表达，“强”变体虽也引起变化但程度较低，而“中”和“弱”变体的影响则微乎其微。

图2 方法A所设计变体与野生型的局部折叠能比较

功能富集分析进一步揭示了减毒变体对宿主细胞通路影响的减弱，野生型病毒的差异表达基因显著富集于71个基因本体生物过程术语和440个C2基因集，而“强”变体仅富集于13个GO术语和147个C2基因集，“中”和“弱”变体则未显示出任何显著富集的功能通路，野生型富集的通路主要涉及内质网应激、蛋白质错误折叠、毒性反应以及干扰素-β产生等，而“强”变体富集的肝脏相关通路则与细胞凋亡、甲基化调控和缺氧相关，这些结果表明减毒变体对细胞功能和相关致病通路（尤其是肝癌相关通路）的扰动远低于野生型病毒。在细胞表型层面，研究人员重点评估了与癌症进展密切相关的细胞侵袭和基质降解能力，结果显示，与野生型病毒感染相比，HCVmut7感染的细胞在基质胶侵袭实验中的侵袭细胞数量显著减少，在明胶降解实验中的降解面积也明显降低，其水平与未感染对照细胞相当，这表明减毒变体HCVmut7未能诱导出野生型病毒所促成的侵袭性表型，进一步支持了其在致病性方面的减弱。

图3 病毒合成NS5变体相对于野生型序列的密码子变化热图

本研究成功展示了一种基于计算生物学理性设计减毒病毒的新策略，并通过实验验证了其在HCV模型中的有效性。通过在同义突变中靶向破坏RNA二级结构、插入低代表性序列或改变保守位点，研究人员构建出了一系列具有不同减毒程度的HCV变体，这些变体在保持抗原蛋白序列不变的前提下，表现出复制能力下降、传播效率降低以及对宿主细胞基因表达和致癌表型扰动减弱的特点，其中部分变体还显示出良好的遗传稳定性。这种方法的核心优势在于其通用性和自动化程度，它仅依赖于病毒的编码序列信息，无需复杂的先验知识或实验数据，因此理论上可应用于大多数病毒，特别是那些目前尚无有效疫苗的病毒，为新一代疫苗的开发提供了新的思路和工具。尽管将减毒HCV病毒转化为实际疫苗仍面临诸多挑战，例如在适合的动物模型中评估其诱导的免疫反应以及确保其在人体中的绝对安全性，但本研究为HCV减毒活疫苗的可行性提供了重要的概念验证，并为应对其他病毒性疾病的疫苗研发开辟了新的道路。

原始出处：

Dabour, R., Bergman, S., Zafir, Z. et al. Silent mutations in coding regions of Hepatitis C virus affect patterns of HCV RNA structures and attenuate viral replication and pathogenesis. Genome Biol 26, 338 (2025). https://doi.org/10.1186/s13059-025-03816-y

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