283例中国癫痫患者：CNV-seq联合WES互补检测提高诊断率，超40%阳性病例优化治疗方案

癫痫的基因病因具有高度异质性与复杂性。拷贝数变异测序（CNV-seq）与全外显子组测序（WES）已成为明确不明原因癫痫患者基因病因的有效工具。本研究旨在探究癫痫的基因病因，评估CNV-seq与WES联合检测的诊断价值，并为精准医疗与遗传咨询提供依据。本研究为回顾性队列研究，纳入283例接受WES检测的不明原因癫痫患者与228例接受CNV-seq检测的患者，部分队列存在重叠（n=228）。研究评估了诊断效率及其与人口统计学信息的相关性，以及基因诊断结果对临床决策的影响。

81例患者（28.6%）获得基因诊断。其中，67例（23.7%）存在单核苷酸变异/插入缺失（SNVs/Indels），13例（4.6%）存在拷贝数变异（CNVs），1例（0.3%）同时存在致病性SNV与CNV的双重分子变异。与单独使用WES（诊断率27.9%，79/283）或CNV-seq（诊断率6.1%，14/228）相比，联合检测将诊断率提升至30.7%（70/228）。家系全外显子组测序（trio-WES）的诊断率（33.3%，7/21）高于仅对先证者进行WES检测（27.5%，72/262）。检出的主要致病基因为SCN1A（n=14）、PRRT2（n=5）、GABRG2（n=4）与TSC1（n=4），同时发现24个新的SNVs/Indels。诊断率与癫痫早发（<3岁：41.5% vs ≥3岁：20.9%；比值比OR（95%CI）：2.685（1.581-4.560），p=2.569×10⁻⁴）及合并其他疾病（45.9% vs 17.4%；OR（95%CI）：4.023（2.338-6.922），p=4.950×10⁻⁷）显著相关。在已明确诊断的病例中，42.0%（34/81）的基因检测结果直接用于优化抗癫痫药物治疗方案。

这种双重测序策略可提高不明原因癫痫的诊断率，且trio-WES能进一步提升诊断效能。强基因型-表型相关性凸显了分子诊断的预后价值，而42%的临床应用率则体现了其转化意义。本研究结果拓展了癫痫的突变谱，加深了对癫痫基因机制的认识。

研究背景

癫痫是一种慢性神经系统疾病，以神经元过度放电引发的反复性、短暂性、发作性神经功能障碍为特征，全球受影响人群超过6100万。癫痫的病因极为多样，包括结构性、基因性、感染性、代谢性及免疫性因素。然而，约半数病例的潜在病因仍不明确。

基因因素在癫痫中发挥关键作用，约20%-30%的癫痫病例与基因相关，且随着检测技术的进步，这一比例仍在上升。值得注意的是，儿童癫痫病例中基因病因占比高达40%，成人中占比为26%。明确基因诊断对癫痫管理至关重要：它可指导临床决策、提供准确的预后信息、改善患者结局、为复发风险评估及产前检测提供遗传咨询依据，并降低医疗成本。与癫痫相关的基因变异涵盖多种序列变异，包括单核苷酸变异（SNVs）、小片段插入/缺失（Indels）及拷贝数变异（CNVs）。过去二十年间，下一代测序（NGS）技术的出现显著加速了癫痫相关新基因及致病性变异的发现。

尽管目前已有多种基因检测手段，如染色体微阵列分析（CMA）、拷贝数变异测序（CNV-seq）、全外显子组测序（WES）及全基因组测序（WGS），但这些方法的诊断率与临床应用价值因患者队列及检测技术的不同而存在差异。虽然这些技术已在大规模癫痫患者队列中广泛应用，但关于CNV-seq/CMA与WES联合检测的相关研究仍较为有限。这种综合检测策略极具应用前景，因其可同时检测小片段序列变异与大片段结构变异，从而提高诊断效率并获得更完整的基因图谱。

本研究采用WES与CNV-seq联合的双重检测策略，对283例中国癫痫患者的基因病因进行探究，旨在评估该整合策略的诊断率，并分析临床特征对致病性变异检出率的影响。研究结果凸显了CNV-seq与WES联合检测在解析癫痫基因结构中的作用，同时为该综合检测策略的临床意义提供了见解。

研究结果

临床特征：

人口统计学数据汇总于表1。本队列共纳入283例不明原因癫痫患者（男性占比54.8%，155/283），与癫痫流行病学中已知的男性占比更高的特征一致。患者癫痫发作的平均（±标准差）年龄为6.5±6.4岁（范围：2个月至32岁），显著早于基因检测的平均（±标准差）年龄[14.1±9.7岁（范围：7个月至51岁）]。从首次癫痫发作到进行基因检测的平均诊断延迟时间为7.6年（中位数：5.0年；四分位距：1.7-12.0年）。仅8.5%（24/283）的患者在首次癫痫发作时接受了基因检测；累计来看，21.6%（61/283）的患者在发作1年内接受检测，70.0%（198/283）的患者检测延迟超过2年，28.6%（81/283）的患者延迟超过10年。如表1所示，39.2%（111/283）的患者存在合并症，例如皮肤异常（6.4%，18/283）和共济失调（5.3%，15/283）；33.9%（96/283）的患者合并其他神经发育障碍，以发育迟缓（DD）、智力障碍（ID）、注意力缺陷多动障碍（ADHD）和孤独症谱系障碍（ASD）为主。

表1

诊断率总结：

所有283例患者均接受了WES，其中228例同时接受了CNV-seq（图1）。28.6%（81/283）的患者明确了基因病因：单独使用WES的阳性检出率为27.9%（79/283）。所有变异的特征详见表2和表3。在明确诊断的病例中，致病性SNVs/Indels占82.7%（67/81），CNVs占16.1%（13/81）；值得注意的是，1例患者（1.2%）同时存在致病性SNV与CNV（图2A）。此外，单独使用CNV-seq的诊断率为6.1%（14/228）；而WES联合CNV-seq的诊断率达30.7%（70/228），高于单独使用WES的29.8%（68/228）。同时，家系全外显子组测序（trio-WES）的诊断率[33.3%（7/21）]优于仅对先证者进行WES检测[27.5%（72/262）]。

图1

表2

表3

图2

诊断性SNVs与Indels：

WES结果显示，68例患者中存在涉及32个基因的66个致病性/可能致病性SNVs与Indels（表2）。值得注意的是，36.4%（24/66）的检出变异为新变异，涉及15个癫痫相关基因，且截至2023年12月尚未在ClinVar或HGMD数据库中报道。尽管需通过功能验证确认致病性，但本研究的变异分类严格遵循美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）指南，允许基于可靠的生物信息学分析与临床标准进行临床解读。计算机分析显示，所有新变异均未在人群数据库中出现，且会破坏进化保守位点，同时具有计算机预测的有害效应。未来研究应优先对这些变异进行功能表征，以填补这一研究空白。

如图2B所示，SNVs/Indels患者中最常见的基因模式为常染色体显性遗传（59/68，86.8%），其次为X连锁遗传（6/68，8.8%）和常染色体隐性遗传（3/68，4.4%）。在66个SNVs/Indels中，错义变异最为常见（32/66，48.5%），其次为无义变异（18/66，27.3%）、移码变异（12/66，18.2%）、剪接变异（3/66，4.5%）和同义变异（1/66，1.5%）（图2C）。在68例基因诊断阳性的患者中，51.5%（35/68）携带遗传性变异：癫痫家族史阳性的患者中，80.0%（24/30）携带遗传性变异（常染色体显性遗传：22例，X连锁遗传：2例）；无家族史的患者中，28.9%（11/38）携带遗传性变异（常染色体显性遗传：6例，常染色体隐性遗传：3例，X连锁遗传：2例）。值得注意的是，无家族史患者的诊断中，新发变异占60.5%（23/38）。这表明，家族史阴性并不能排除基因病因——在本队列中，新发SNVs/Indels占分子诊断的35.3%（24/68）（表2、图2D）。

此外，SCN1A是突变频率最高的基因（20.6%，14/68），其次为PRRT2（7.4%，5/68），TSC1与GABRG2并列第三（各5.9%，4/68）。DEPDC5、NF1、KCNT1、SLC2A1、NRPL3、CACNA1A、NUS1、COL4A2、GABRA1、TSC2、LGI1、DCX、NEXMIF基因各在2例患者中检出变异（各2.9%）；ADSL、CHRNB2、GABRB3、ATP1A3、SLC25A15、SETBP1、CLN5、ARHGEF9、KCNQ2、KMT2D、SCN8A、SYNGAP1、KIF1A、PPP3CA、IQSEC2基因各在1例患者中检出变异（各1.5%）（图3）。

图3

WES与CNV-seq检出的诊断性CNVs：

14例患者中检出11个致病性CNVs，大小范围为100kb至5.78Mb（表3）。所有CNVs均通过CNV-seq成功检出；而WES初步分析仅在12例患者中检出CNVs，一致性率为85.7%（12/14）。值得注意的是，2个特定CNVs（涉及2例患者，占CNV阳性患者的14.3%）在WES初步分析阶段未被检出。

63.6%（7/11）的致病性CNVs与已知综合征相关，例如16p13.11微缺失综合征和15q11.2缺失综合征；72.7%（8/11）的CNVs包含癫痫相关基因。例如，患者CG273的2q24.3区域存在一个0.48Mb的缺失，该缺失区域包含已明确的癫痫相关基因SCN1A和SCN9A。此外，最常见的频发性致病性CNV为16p11.2缺失，在3例患者中检出（表3）。由于临床特征可变且外显率降低，该缺失被视为癫痫易感因素。值得注意的是，本队列中频繁发生SNVs/Indels突变的PRRT2基因（表2、表3），正位于16p11.2复发性缺失区域内。总体而言，涉及PRRT2基因的致病性变异（包括包含PRRT2的CNV缺失或PRRT2基因内SNVs/Indels）在8例患者中检出，约占队列中所有分子诊断的9.9%（8/81）。

染色体分布分析显示，候选致病性变异分布于17条染色体上：CNVs主要富集于16号、15号和X染色体，而SNVs/Indels主要富集于2号和16号染色体。值得注意的是，19.8%（16/81）的阳性病例变异位于2号染色体（15例为SNVs，1例为CNV）；18.5%（15/81）的阳性病例变异位于16号染色体（9例为SNVs，6例为CNVs）。

临床特征与基因诊断的相关性：

本研究进一步分析了诊断率与临床特征的关系，重点关注两个关键方面。一方面，诊断阳性患者的癫痫发作年龄更早（阳性患者平均发作年龄为4.6岁，阴性患者为7.3岁，表1）；且不同发作年龄患者的诊断率存在显著差异[比值比OR（95%CI）：0.726（0.604-0.874），p=6.869×10⁻⁴]。出生后3年内（婴儿期：0-1岁，幼儿期：1-3岁）发作的患者，诊断率显著更高[分别为42.2%（19/45）和41.0%（25/61）]，而3岁及以上发作的患者诊断率较低[3-6岁：26.9%；6-12岁：17.2%；12-18岁：18.6%；≥18岁：22.2%；发作年龄<3岁vs≥3岁：44/106 vs 37/177，OR（95%CI）：2.685（1.581-4.560），p=2.569×10⁻⁴]（表1）。另一方面，临床表型与检出率显著相关：诊断阳性的患者中，合并其他临床表型的比例更高[30/172 vs 51/111，OR（95%CI）：4.023（2.338-6.922），p=4.950×10⁻⁷]。其中，合并其他临床表型、其他神经发育障碍或皮肤异常的患者，更可能存在潜在基因病因，诊断率分别为45.9%（51/111）、45.8%（44/96）和77.8%（14/18）。然而，性别、出生史、家族史、脑部MRI结果、癫痫发作类型等其他特征，在检出率方面未显示出统计学差异（表1）。

此外，CNVs的诊断率也与癫痫发作年龄及临床表现密切相关：64.3%（9/14）的候选CNV阳性患者属于婴儿期或幼儿期群体，78.6%（11/14）的CNV阳性患者在6岁前发作。值得注意的是，14例CNV诊断阳性的患者中，9例（64.3%，9/14）合并其他临床表型，以发育迟缓与智力障碍为主（表3）。

基因诊断的临床应用价值：

在81例诊断阳性的患者中，34例（42.0%）的基因诊断结果直接改变了治疗或临床管理方案，包括调整抗癫痫药物（ASMs）或选择手术治疗。例如，患者CG104为7月龄女婴，其母亲在7月龄时也曾出现类似癫痫发作（1岁内发作3-4次），目前患有阵发性运动诱发性运动障碍（PKD）。该患儿在基因检测前接受左乙拉西坦治疗，但自4月龄起仍每日发作1-2次（后续发作频率降至每4-5天1次）。基因检测显示，其PRRT2基因存在频发性致病性变异c.649dupC（p.Arg217Profs*8）。根据基因检测结果，临床改用奥卡西平治疗；在后续随访期间，患儿未再出现癫痫发作。

此外，基因检测对家庭遗传咨询至关重要。例如，患者CG181在6岁时首次发作，7岁时出现智力倒退与黑矇。基因检测显示，其CLN5基因存在纯合变异c.188G>A（p.Arg63His），其父母均为该变异的杂合携带者。该患者有1名5岁的妹妹，目前表型正常；Sanger测序证实，其妹妹为该变异的杂合携带者（无发病风险）。

讨 论

尽管CNV-seq与WES的联合应用已在神经发育障碍疾病中显示出价值，但在大规模癫痫队列中的应用仍有待深入探索。本研究纳入283例不明原因癫痫患者，通过WES与CNV-seq联合检测，总体诊断率达28.6%，同时发现24个新变异，丰富了癫痫相关基因的突变谱。值得注意的是，37.0%（30/81）的诊断病例变异涉及16号和2号染色体——这两条染色体是已知的频发性CNV热点区域（如16p11.2缺失）及高外显率癫痫基因（如SCN1A）的富集区域，凸显了WES与CNV-seq在捕获小片段变异及染色体水平变异方面的互补作用。

与既往研究一致，本研究发现癫痫早发或合并其他疾病（如神经发育障碍，包括智力障碍、发育迟缓；皮肤异常，如咖啡斑）的患者诊断率显著更高。例如，Zhang等在一项中国队列研究中报道，合并DD/ID的患者诊断率[64.5%（71/110）]显著高于无DD/ID的患者[18.9%（21/111），P<0.001]。本队列中，3岁前发作的患者诊断率为41.5%（44/106），是3岁后发作患者[20.9%（37/177），p=2.569×10⁻⁴]的两倍。晚发性癫痫（≥18岁）患者诊断率为22.2%（4/18），其中3例合并其他表型：皮肤特征[咖啡斑，患者CG111（TSC1：c.1641_1642del）和CG186（TSC2：c.1832G>A）]及神经系统特征[发育迟缓，患者CG173（CACNA1A：c.5752C>T）]。这些结果提示，对于合并皮肤或神经发育异常的老年癫痫患者，应优先考虑基因检测。尤为关键的是，患者CG186经基因诊断明确为TSC2变异后，在丙戊酸钠联合卡马西平治疗失败的情况下接受了手术评估，充分体现了基因诊断的临床价值。此外，57.1%（8/14）合并皮肤异常的患者携带NF1或TSC1/TSC2致病性变异；6岁前发作且合并发育迟缓的患者中，78.6%（11/14）的诊断由CNVs解释。这些发现强调，在临床基因组学分析中，需基于表型进行变异优先级排序，尤其对于早发且合并其他疾病的病例，CNV分析至关重要。

本研究数据挑战了“家族史阴性即可排除基因病因”这一临床误区。在散发病例中，新发SNVs/Indels占诊断的60.5%，在所有分子诊断中占35.3%——这与“约55%携带致病性SNVs的癫痫病例为新发变异”的报道一致。此外，28.9%（11/38）无家族史的患者携带遗传性变异，包括常染色体隐性遗传病例（如患者CG241，其父母为无症状携带者，患者自身携带SLC25A15复合杂合变异）。这些结果表明，无论家族史是否阳性，基因检测均具有临床必要性。有趣的是，局灶性癫痫患者的诊断率达26.6%，打破了“局灶性癫痫遗传负荷低”的固有认知——这一结果可能得益于WES联合CNV分析的全面基因检测策略。局灶性癫痫的诊断变异包括致病性CNVs（4例）、mTOR通路变异（TSC1/TSC2，5例）、钠通道病（SCN1A，5例）及常见局灶性癫痫相关基因变异（NPRL3、LGI1、DEPDC5、CHRNB2、KCNT1，8例）。这些结果与近期研究结论一致，即局灶性癫痫的基因诊断率较高（如WGS诊断率39.5%，WES/WGS诊断率34.8%）。

本研究的诊断率与癫痫检测相关Meta分析结果一致：WES诊断率27.9%，CNV-seq诊断率6.1%，与既往报道的WES（24%）及染色体微阵列分析（CMA，9%）诊断率相近。尽管家系全外显子组测序（trio-WES）诊断率高于仅先证者WES，但差异无统计学意义（p=0.565），这可能因trio样本量有限（n=21）所致——这一结果也与Meta分析中“trio-WES诊断率较先证者单独测序高1.3倍，尤其在神经发育障碍疾病中”的结论一致。诊断率受队列特征与基因检测方法双重影响。值得注意的是，85.7%（12/14）的CNV-seq检出结果可在WES数据中识别；2个CNVs（患者CG8：16p11.2区域0.54Mb缺失，患者CG85：15q11.2区域0.34Mb缺失）在WES初步分析中未被检出，但经重新分析后成功识别——因其片段较小，初始解读时被遗漏。将CNV分析整合到WES中，可提高罕见单基因疾病（尤其神经发育障碍疾病）的诊断率（最高达18%）。这种双重分析策略在资源有限的环境中尤为优势，可降低测序成本、缩短诊断时间，是兼具成本效益的一线诊断工具。尽管基于WES的CNV分析可有效识别外显子水平至染色体水平的变异，但在平衡易位、小片段（<3个外显子）或嵌合CNVs及低覆盖度区域的检测中仍存在局限。因此，开发并优化基于外显子组的CNV检测算法，对提高检测敏感性、降低假阳性与假阴性率至关重要。本研究结果支持“先进行WES检测，再开展CNV分析”的策略，这与Krey等提出的“将WES或全基因组测序（含CNV分析）作为癫痫患者一级检测手段”的建议一致；同时，本研究也推荐优先开展trio-WES检测。

患者GC142同时携带致病性SCN1A变异[NM_001165963.4：c.1177C>T（p.Arg393Cys）]与16p11.2缺失，提示在严重早发性癫痫中可能存在寡基因致病机制——但其协同致病性仍需功能验证确认。Zou等曾报道2例同时存在致病性SNVs与CNVs的特殊病例，凸显了“先CNV-seq后WES”或“先WES后CNV-seq”的序贯检测策略可能导致漏诊。这些发现强调，需同时进行SNV与CNV分析（以识别双重或多重分子变异），避免诊断遗漏。本研究中，SCN1A是突变频率最高的基因（17.3%，14/81），其次为PRRT2、TSC1与GABRG2（各4-5例）。尽管总体结果与既往报道一致，但仍存在细微差异：例如，Zou等报道最常见突变基因为SCN1A（10.5%，10/95），其次为PRRT2（8.4%，8/95）与TSC2（7.4%，7/95）；而一项纳入超2.5万例患者的Meta分析显示，KCNQ2与SCN2A的突变频率高于PRRT2。此外，在患者CG31（TSC2）、CG42/CG92（COL4A2）、CG55/CG282（NPRL3）及CG77/CG98（SCN1A）的无症状父母中观察到变异外显不全现象，提示在诊断与遗传咨询过程中，需开展分离分析，并结合多基因风险评分进行多模式咨询。

新变异的发现为多学科国际合作网络及变异数据库提供了宝贵资源，可能助力深入解析癫痫的潜在发病机制。本研究还识别出在少数病例中报道过的基因变异（包括已知变异与新变异），如ADSL、NUS1、PPP3CA、SLC25A15、GABRA1与NEXMIF。例如，患者CG84携带已知的PPP3CA变异，该变异与发育性癫痫性脑病91型（DEE91）相关——目前PPP3CA变异仅在35例个体中报道。与文献报道一致，患者CG84在2岁时出现强直发作，自幼存在精神运动发育迟缓；磁共振成像（MRI）结果正常，但脑电图（EEG）显示发作间期癫痫样放电。此外，在患者CG46与CG203中发现2个新的致病性NUS1变异（c.640A>T/p.Lys214*与c.279del/p.Leu94Trpfs*11），两例患者均表现为早发性癫痫（CG46为1岁6个月，CG203为出生后2个月）、发育迟缓、智力障碍与共济失调，与伴癫痫的智力发育障碍55型（MRD55）表型一致。

癫痫基因诊断的临床价值已得到充分证实，其可指导ASMs选择、减少有创检查、预测预后，并为患者及高危亲属提供生育决策信息或级联检测依据。本队列中，42.0%（34/81）的诊断阳性患者（如SCN1A或TSC2变异携带者）接受了基于基因型的治疗调整，这与近期报道的41.0%（29/71）的比例一致。例如，携带SCN1A变异的患者应避免使用钠通道阻滞剂（如拉莫三嗪、卡马西平、苯妥英钠、奥卡西平），因这类药物可能加重癫痫发作；对于GLUT1缺乏症患者，推荐采用生酮饮食治疗。患者CG278携带ADSL基因复合杂合变异，基因诊断不仅明确了病因，还为其父母提供了产前诊断或辅助生殖技术的选择依据。尽管基因检测在癫痫中的临床价值已明确，但本研究仍观察到显著的检测延迟：仅21.6%的患者在发作1年内接受检测，49.5%（140/283）的患者延迟超过5年，28.6%（81/283）的患者延迟超过10年。这一现象可能源于：（1）既往基因检测技术可及性有限；（2）老年患者转诊延迟；（3）临床医生认知不足。因此，亟需采取干预措施（如优化转诊流程、开展针对性医师培训）以推动早期基因诊断，从而避免治疗失误、实现精准管理。此外，近期一项队列研究显示，尽管59%的基因诊断阳性患者理论上可接受精准治疗，但实际仅32%的患者获得精准治疗——其主要障碍在于部分靶向药物可及性低且缺乏医保覆盖。因此，建立公开可及的变异-治疗数据库、开展潜在靶向治疗的临床研究、推动靶向药物纳入医保，是未来的关键工作方向。

然而，本研究仍存在若干局限性。首先，作为单中心回顾性研究，尽管采用标准化流程，但仍可能存在选择偏倚与信息偏倚，影响结果的外推性。未来需通过中国多中心合作（尤其我国南方/西部地区的三级医院）验证本研究结论；其次，父母样本缺失限制了变异来源追溯与解读；第三，尽管美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）标准为变异解读提供了可靠框架，但新变异的功能验证（如SCN1A变异的体外电生理实验）缺失仍是局限，未来需通过扩大病例报道或功能分析确认这些变异的致病性；最后，本研究未全面探索影像学结果与治疗疗效的长期随访数据，未来需开展扩大队列的前瞻性研究，以完善基因型-表型关联、优化精准治疗方案。

本研究阐明了中国癫痫患者队列的基因谱，通过CNV-seq与WES整合分析，诊断率达30.7%（70/228）。研究结果为基因型-表型分析提供了参考，并发现24个新变异，拓展了15个癫痫相关基因的突变谱。本研究强调癫痫病因复杂（如寡基因相互作用，占诊断病例的1.2%，1/81），需同时进行SNV与CNV分析。尽管基于WES的CNV检测可捕获85.7%的CNV-seq结果，但小片段CNV的识别仍需人工审核。基因诊断为42.0%的诊断阳性患者优化了临床管理。此外，本研究数据进一步支持：对于早发性癫痫或合并其他表型的患者，应尽早开展含CNV分析的WES检测，尤其推荐trio-WES。

“遗传病全外显子组检测”项目，针对单基因遗传病，全外显子检测2万+个目标基因(包含线粒体)，覆盖点突变（SNV）、小片段插入缺失(Indel)、以及预测基因扩增（CNV）等变异类型，评估单基因遗传病及遗传性肿瘤的发病风险。“遗传病染色体异常CNV-seq检测”项目，通过CNV-seq检测排查患者染色体层面的异常（三体、≥100kb的染色体片段微缺失或微重复等）。

参考文献：

Hu J, Xin M, Liu J, et al. Genetic etiology of 283 Chinese individuals with epilepsy using copy number variation sequencing and whole exome sequencing: a single-center cohort study. BMC Med Genomics. 2025;18(1):117. Published 2025 Jul 15. doi:10.1186/s12920-025-02184-7