三维超分辨成像，最新nature Methods！

三维纳米尺度成像对于揭示亚细胞结构的精细形态至关重要，然而传统的单分子定位显微镜受限于轴向分辨率不足，导致成像结果在三维空间中存在显著的各向异性。尽管基于像散等点扩散函数工程的方法在一定程度上实现了三维定位，但其轴向分辨率通常低于横向分辨率2-3倍，且在离焦条件下性能进一步下降。近年来，干涉定位方法如ROSE-Z和4PI-SMS提高了轴向分辨率，但横向定位仍依赖质心拟合，未能实现真正的各向同性分辨率。此外，现有方法多局限于盖玻片表面附近，难以对厚度达数微米的完整细胞进行均匀成像。因此，开发一种能够在整个成像深度内实现各向同性、高分辨率的三维成像技术，已成为超分辨显微镜领域的重要挑战。

近日，中国科学院生物物理研究所徐涛，纪伟和谷陆生团队提出了一种名为ROSE-3D的干涉定位超分辨成像技术，首次在三维空间中实现分子尺度各向同性分辨率，能够在整个成像深度内对细胞结构进行均匀、高精度的纳米级成像。相关内容以“Molecular-scale isotropic 3D super-resolution microscopy via interference localization”为题，发表在《Nature Methods》。

主要内容

图1：ROSE-3D的工作原理与性能评估

ROSE-3D是一种基于三维干涉定位的单分子成像技术。其光学系统包含照明路径和成像路径：照明路径利用电光偏转器和调制器，在x、y、z三个方向上快速切换并生成干涉条纹；成像路径则通过高速共振扫描镜将九个子图像投影至sCMOS相机，实现同步采集与最小化荧光分子动态行为引起的误差。通过DNA-PAINT实验对定位精度进行评估，结果显示在1.2 μm的景深范围内，ROSE-3D在x、y、z三个方向上的平均定位精度分别为3.5 nm、3.3 nm和3.8 nm，且离焦条件下误差增幅显著低于传统方法，验证了其各向同性和高稳定性。

图2：ROSE-3D在整个景深内实现各向同性分辨率

该图通过20 nm DNA折纸结构和微管蛋白的成像结果，展示了ROSE-3D在全景深范围内的均匀分辨率。与传统方法相比，ROSE-3D在离焦400 nm时仍能清晰重建DNA折纸的网格结构，而传统方法则因点扩散函数展宽而模糊。在COS-7细胞的微管成像中，ROSE-3D成功解析出直径约50 nm的微管中空结构，且在1 μm厚度内分辨率保持一致，凸显了其在三维细胞结构成像中的优越性。

图3：ROSE-3D的多色与全细胞成像能力

通过同时标记微管蛋白与线粒体外膜蛋白TOM-20，ROSE-3D实现了双色成像且串扰低于0.5%。实验结果显示，微管的中空结构与线粒体外膜在不同深度下均被清晰解析。此外，通过压电平台进行多层扫描，ROSE-3D成功重建了厚度约3 μm的线粒体网络，表明其适用于厚样本的全细胞成像，且在整个视野内分辨率均匀。

图4：ROSE-3D解析核纤层蛋白的各向同性结构

核纤层蛋白Lamin A/C和Lamin B在细胞核结构与功能中起关键作用，但其三维空间关系难以通过传统光学显微镜解析。ROSE-3D对厚度约4.3 μm的细胞核进行成像，结果显示Lamin A/C位于Lamin B的内侧，两者间距约10 nm。该结构在轴向与横向上均保持一致，证明了ROSE-3D在完整细胞核尺度实现各向同性分辨率的能力。

图5：ROSE-3D原位解析DRP1蛋白组装体结构

线粒体分裂关键蛋白DRP1在分裂位点常形成环状或螺旋状组装体，但其原位结构尚未清晰解析。通过三色成像标记DRP1、MID49和TOM-20，ROSE-3D成功观察到DRP1在分裂位点形成的环状与螺旋状结构，并测量其直径与螺距。DRP1位于线粒体外膜外侧约20 nm处，与TOM-20和MID49的空间关系符合其膜招募功能，展示了ROSE-3D在解析蛋白质复合物原位结构方面的强大潜力。

全文总结与展望

本研究开发的ROSE-3D技术，通过在全三维空间应用干涉定位，成功实现了分子尺度的各向同性超分辨成像。与传统方法相比，ROSE-3D在景深范围内定位精度提升2–8倍，且在多色成像、全细胞及厚样本成像中均表现出优异性能。该技术不仅成功解析了核纤层蛋白的三维排布与线粒体分裂蛋白DRP1的原位组装结构，也为研究细胞内纳米尺度架构提供了强大工具。尽管ROSE-3D在光学设计与相位稳定性方面仍面临挑战，但其在细胞生物学与结构研究中的应用前景广阔。未来通过结合自适应光学、算法优化与样本前处理技术，ROSE-3D有望进一步推动超分辨成像向更深、更清晰、更全面的三维分子尺度探测迈进。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41592-025-02911-z