以毒攻毒！德国改造病毒以对抗超级细菌！

噬菌体是细菌的天敌，是一种针对超级细菌颇具前景的解决方案。地球上有数百万种不同类型的噬菌体，每一种都专门针对某些细菌。在自然界中，噬菌体利用细菌进行繁殖：它们将自己的DNA插入细菌中，利用细菌的物质迅速繁殖，最终杀死细菌并继续感染新细菌。噬菌体可攻击和破坏特定类型的细菌，发挥具有针对性的类抗生素作用。因此，科学家们纷纷把目光转向噬菌体，以期改造噬菌体对抗超级细菌，其中，德国科学家已取得突破性进展。

2022年7月11日，德国慕尼黑工业大学研究团队在Cell Chemical Biology发表题为“Cell-free production of personalized therapeutic phages targeting multidrug-resistant bacteria”的研究成果（图1）[1]。研究结果表明可在无细胞营养液中靶向生产功能性噬菌体：将纯化的噬菌体DNA注入到含有基于大肠杆菌细胞提取物、缓冲液和代谢物的无细胞系统，噬菌体DNA会在几秒内组装出数千个功能性噬菌体。基于此，通过将噬菌体DNA与抗生素耐药性细菌共培养，分离出新型噬菌体，并成功对抗多重耐药菌。

图1 研究成果（图源：[1]） 

抗生素耐药性在革兰氏阴性菌中尤为严重，大多数为大肠杆菌。临床治疗发现病原体越来越耐药，在新冠患者的细菌重复感染中经常发现耐药菌，尤其是肺炎克雷伯菌。噬菌体虽然作为广为关注的疗法，但其天然和工程生产过程存在相当大的生物安全问题，而且效率相对低下且不可靠。噬菌体扩增和工程改造都需要病原宿主的纯培养，这个过程带来了高风险的噬菌体污染；用细菌培养噬菌体的标准很耗时，产生的滴度相对较低，并且需要针对相应病原体的实验室安全级别；工程化噬菌体的生产受限于在活细菌中修改噬菌体基因组；噬菌体蛋白表达和功能的信息不足，对噬菌体-宿主相互作用的有限了解可能导致不稳定的治疗结果。

针对上述挑战，研究人员推断无细胞生产系统可以解决上述所有挑战：（1）高效安全地生产高滴度的噬菌体；（2）促进噬菌体工程的新方法；（3）能够更好地表征噬菌体蛋白质组和功能，这对于进一步改进噬菌体疗法至关重要。在此项研究中，研究人员首先通过构建噬菌体生产模型验证无细胞生产系统可以独立于宿主的方式，按需和安全地生产噬菌体，包括针对抗生素抗性细菌的瞬时工程噬菌和治疗性噬菌体；随后，对生产的噬菌体蛋白质组表征，验证假设蛋白质的存在；最后，临床验证按需生产的治疗性噬菌体对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株的功效（图2）。

图2 治疗性噬菌体无细胞平台（图源：[1]）

结果发现： 

1 无细胞生产噬菌体系统可高效生产治疗性噬菌体

具有额外宿主因子和拥挤试剂的优化转录翻译系统可以产生靶向广泛的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的噬菌体。非基因组噬菌体工程可以安全地为噬菌体添加瞬时功能。无细胞产生的噬菌体无需纯化即可通过质谱分析，有助于鉴定非结构噬菌体蛋白。时间分辨蛋白质组学分析可以进一步与噬菌体组装过程相关联。在微升规模上，一锅法反应能够在数小时内以临床相关的滴度生产针对多重耐药细菌的治疗性噬菌体（图3）。

图3 用于治疗性噬菌体逆向和正向工程的无细胞平台（图源：[1]） 

2 无细胞系统可检测到表征蛋白质，并产生约50%假设蛋白

研究人员将基于大肠杆菌细胞提取物、缓冲液和代谢物的无细胞系统与纯化的噬菌体DNA混合，从而组装出功能性噬菌体；随后，将源自经典细菌依赖性扩增（噬菌体原液）的模型T7噬菌体的蛋白质组成与细胞中合成的噬菌体进行了比较。对来自经典细菌培养物和无细胞产生的噬菌体进行凝胶内消化，并通过与串联质谱联用的高分辨率液相色谱法（LC-MS/MS）进行分析。结果发现无细胞系统产生的噬菌体的蛋白质组覆盖率为72%（57个中的41个），其中28%（16个蛋白质）为假设蛋白质；蛋白质的无偏聚类表明总体上有两组蛋白质，结构蛋白对应的蛋白更丰富，而非结构蛋白质的丰度较低，且在噬菌体原液样品中的丰度远低于无细胞产品中的丰度。

为了验证无细胞系统是否可以产生特定的噬菌体，研究人员选择了针对致病性肠聚集性大肠杆菌的噬菌体CLB-P3。通过将二者进行无细胞培养，并进行蛋白质组学分析发现可检测到两个样本中的大部分CLB-P3噬菌体蛋白，但无细胞系统的结果更稳定。LC-MS/MS鉴定出87种预测蛋白质中的68种，这68种蛋白质中只有38种可以根据基因组注释直接指定功能名称，剩下的30个被标记为“假设”；CLB-P3的可溶性因子的强度在噬菌体原液样品中低于无细胞系统。

3 无细胞系统中特定噬菌体可在60-90分钟内完成

无细胞系统的大多数噬菌体蛋白在40分钟后出现，但完全组装和功能性噬菌体在60分钟首次出现。第一个组装的噬菌体在60到90分钟之间，这些蛋白质似乎是组装全功能噬菌体或从细菌中释放噬菌体的限制因素。

4 几微升定制化治疗性噬菌体可在30分钟内裂解耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌

研究人员从患者皮肤中分离出一种抗生素无法治疗的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌；然后，在肺炎克雷伯菌菌株中扩增噬菌体DNA，并分离噬菌体；最后，将无细胞系统中产生的噬菌体添加到病原菌中，发现噬菌体在30分钟内裂解病原菌，且只需几微升的一锅反应即可产生足够的噬菌体滴度。

 5 无细胞系统可产生针对革兰氏阳性菌的噬菌体

为了证明除针对革兰氏阴性菌的噬菌体之外的普遍性，研究人员利用无细胞系统生产噬菌体Phi29和Goe1，二者以革兰氏枯草芽孢杆菌为目标细菌。噬菌体基因组的早期基因通常由宿主的RNA聚合酶转录。因此，研究人员推断通过掺入枯草芽孢杆菌管家sigma因子SigA来修饰大肠杆菌RNA聚合酶应该能够产生特定噬菌体。大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的RNA聚合酶全酶显示出96.5%的序列相似性，并且sigma因子被证明是可互换的。

点测定显示二者共同表达了相应的SigA宿主因子，表明这种修饰能够组装靶向枯草芽孢杆菌的噬菌体；只有SigA、噬菌体DNA和无细胞系统的组合导致了功能性噬菌体的产生，其噬菌斑大小与其细菌宿主中扩增的噬菌体相同。这些数据表明，无细胞系统产生的噬菌体可以扩展到针对革兰氏阳性菌的重要噬菌体类别。

此项研究创立的无细胞系统是一种无细胞噬菌体生产和分析管道，可促进潜在临床相关噬菌体宿主的独立一锅合成，从而实现噬菌体蛋白和噬菌体工程的系统鉴定。然而，其他噬菌体无细胞生产的成功仍然受到与其他宿主蛋白相互作用所需的知识、膜成分的存在和DNA包装机制的限制。 

慕尼黑工业大学神经生物学工程教授Gil Westmeyer表示：“噬菌体为传染性细菌性疾病的高效、个性化治疗提供了巨大的潜力。在过去，不可能以有针对性、可重复、安全和有效的方式生产噬菌体。我们的研究证明了无细胞生产个性化医疗有效噬菌体的可行性，该方法也可用于解决多重耐药性细菌感染，尽管这项工作仍处于基础研究阶段，但该方法仍有可能进行临床试验。”

目前，研究小组开发了一种新的受控生产方法来制造用于治疗的噬菌体。这项技术的基础是由慕尼黑工业大学和路德维希马克西米利安大学的一群学生建立的，他们在2018年国际基因工程机器竞赛中获奖。随后，该小组成立了初创公司Invitris，该公司目前正在开发基于噬菌体药物的平台技术。这项新技术已经在专利申请过程中，现在正在慕尼黑工业大学的新研究中使用。

参考资料：

[1]Emslander Q, Vogele K, Braun P, et al. Cell-free production of personalized therapeutic phages targeting multidrug-resistant bacteria. Cell Chem Biol. 2022 Jul 6:S2451-9456(22)00235-5. doi: 10.1016/j.chembiol.2022.06.003. Epub ahead of print. PMID: 35820417.