四川大学Biomaterials：免疫自适应3D打印支架通过工程化巨噬细胞捕获陷阱促进内源性成骨

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背景介绍

骨修复依赖于炎症期、修复期和重塑期之间的平滑过渡，巨噬细胞的动态表型转换是贯穿全过程的核心调控节点：M1型巨噬细胞在早期炎症期介导碎片清除和免疫激活，而及时向M2型表型转换则促进血管生成、间充质干细胞募集和骨基质形成。然而，现有骨修复支架多为静态设计，忽略了骨愈合过程中动态演变的免疫微环境。目前的免疫调节策略多依赖生物活性因子递送或外源能量刺激，虽可快速调节免疫反应，但存在释放失控、免疫排斥和能量供给有限等风险，更重要的是，过早或持续的抗炎活性可能抑制M1巨噬细胞在早期炎症中的必要功能，最终延迟组织再生。

研究思路

针对上述挑战，四川大学孙勇教授、樊渝江教授团队开发了一种免疫自适应3D打印支架，将工程化巨噬细胞捕获陷阱整合到PLGA/羟基磷灰石微球复合框架上。该支架利用高分子量透明质酸（HA）在体内原位形成多孔HA网络，通过CD44受体介导的识别选择性富集巨噬细胞并动态引导其极化。肌肉内植入实验证实支架富集的巨噬细胞在第3天呈现M1表型，第7天转换为M2表型。兔颅骨缺损模型的组学分析揭示，支架释放的HA被巨噬细胞吞噬后进入溶酶体，激活抗氧化通路（NRROS、SESN2、G6PD），降低胞内活性氧和活性氮水平，驱动巨噬细胞从M1向M2转换，加速血管化和骨基质沉积。相关内容以 "An Immune-Adaptive 3D-Printed Scaffold Promotes Endogenous Osteogenesis by Engineered Macrophage Capture Traps" 发表在 《Biomaterials》！

图片解析

图1. PHA支架制备与体内巨噬细胞捕获网络构建示意图： PHA支架通过超声分散、3D打印和超临界CO₂发泡技术制备，在体内原位形成多孔HA功能网络。早期炎症期（1周）高效捕获游离M1巨噬细胞，随着巨噬细胞持续吞噬释放的HA，G6PD、NRROS和SESN2功能增强，有效清除ROS/RNS，逐渐诱导巨噬细胞向M2表型极化（2周），最终促进骨再生（3个月）。

图2. PHA中多孔HA水凝胶膜网络的构建与理化表征： (a) PHA制备流程示意图。(b) PHA支架表面拉曼映射显示HA均匀分布。(c) 不同时间点支架表面HA网络的SEM图像。(d-f) 初始和72小时HA洗脱的扩展景深光学图像及HA网络构建过程示意图。(g-h) HA水凝胶膜的流变学测试显示DMSO处理使粘度降低53.46%。(i) HA分子内及HA与水分子间氢键示意图。(j) PHA和PHA-O接触角测量。(k-l) PHA和PHA-O动态摩擦系数测试。

图3. HA网络介导的巨噬细胞捕获与极化及大鼠短期肌内植入： (a) 体外实验示意图。(b) 剪切应力下动态细胞粘附实验示意图。(c) FDA染色CLSM图像显示PHA组巨噬细胞滞留密度显著高于PHA-O组。(d) CCK-8定量证实PHA组捕获巨噬细胞数量最多。(e-g) CD86/CD206免疫荧光染色及半定量分析显示7天共培养后PHA组巨噬细胞向M2极化。(h-j) 流式细胞术证实PHA组CD206表达升高、CD86降低。(k) 大鼠肌内植入实验示意图。(l) 第7天巨噬细胞相关细胞因子分泌检测显示PHA组TGF-β和IL-10升高、TNF-α和IL-1β降低。(m) SEM显示PHA组第3天和第7天支架表面可见HA网络。(n) 第7天免疫荧光证实PHA组巨噬细胞向M2极化。

图4. 工程化巨噬细胞捕获陷阱调控细胞行为的机制： (a1-2) Masson染色显示PHA-O组组织中散在游离巨噬细胞（绿色箭头）和新血管（红色箭头）。(b1-2) CD86/CD206染色及(c1-2)半定量分析显示PHA组M2/M1比值显著升高。(d1-2) ARG1/IL-6双染显示PHA组ARG1荧光强度增至84.5%、IL-6降至15.5%。(e) KEGG通路富集显示PHA上调碳水化合物代谢、溶酶体、吞噬体和细胞迁移通路。(f) GO富集桑基点图显示PHA上调吞噬、溶酶体消化、多糖/ROS代谢和血管发育通路。(g) 溶酶体信号通路环形热图。(h) 机制示意图：HA经CD44识别后，巨噬细胞激活PIKFYVE/CLTC将HA吞噬入溶酶体，上调G6PD/SESN2/NRROS，清除ROS/RNS，驱动M2极化。(i) qPCR验证相关基因表达。(j) CD44免疫组化染色显示PHA组巨噬细胞CD44荧光强度更强。(k) RhB-HA（红色）与Lyso-Tracker Green（绿色）共定位CLSM图像证实HA被吞噬入溶酶体。(l) TEM显示PHA组巨噬细胞含丰富溶酶体（红色箭头）、丝状伪足（绿色箭头）和内质网（蓝色箭头）。(m) LAMP1/iNOS双染显示PHA组LAMP1高、iNOS低。(n) NO浓度和(o-p) ROS荧光染色及半定量显示PHA组显著降低。

图5. PHA捕获的M2极化巨噬细胞促进成骨和血管生成： (a) 体外细胞实验示意图。(b) ELISA检测显示PHA组培养基中IL-10和TGF-β升高、IL-1β和TNF-α降低。(c1-2) ALP和ARS染色及(d1-2)定量分析显示PHA组成骨活性最高。(e1-2) OCN和VEGF免疫荧光染色及(f1-2)半定量分析显示PHA组成骨和血管生成蛋白表达最高。(g-h) HUVEC管形成实验及定量分析显示PHA组血管网络最丰富。(i) qPCR显示PHA组成骨和血管生成相关基因表达最高。

图6. PHA支架的矿化、成骨和血管生成效果： (a) 体内实验示意图。(b) Micro-CT三维重建显示PHA组矿化体积更大。(c-f) 定量分析显示PHA组邻近区和向内生长区矿化体积分数和矿化表面密度均显著高于PHA-O组。(g) H&E染色（绿色箭头示新骨）和Masson染色（红色箭头示新血管）显示PHA组新骨和新血管形成更丰富。(h-j) BMP-2/VEGF免疫荧光染色及半定量分析显示PHA组成骨和血管生成活性显著更高。

结论

本研究利用HMW HA的理化性质，在3DP PHA支架表面构建了巨噬细胞靶向捕获陷阱网络。在炎症期，该网络通过巨噬细胞表面CD44受体的特异性识别实现高效M1巨噬细胞驻留和富集。随后，巨噬细胞吞噬HA并转运至溶酶体，溶酶体降解活性和代谢调控激活碳水化合物和ROS代谢通路，上调G6PD、NRROS和SESN2，共同降低胞内ROS和RNS水平，促进巨噬细胞从M1向M2表型转换。基于此机制，HA捕获网络实现了从早期炎症期向抗炎修复期的平滑过渡，显著增强了BMSCs的成骨和成血管分化能力，最终加速骨再生。该策略通过将聚合HA的释放速率与巨噬细胞的功能时间线相匹配，实现了从炎症清除到组织重塑的平滑转换，为骨再生的免疫调节提供了仿生动态新策略。