Neuro Oncol：非典型畸胎样/横纹肌样瘤ATRT的激酶抑制剂敏感性筛选和新靶点发现

横纹肌样瘤(RT)是主要发生于婴幼儿的一种高度恶性肿瘤，可出现在非中枢神经系统和中枢神经系统。中枢神经系统横纹肌样瘤也称为非典型畸胎样/横纹肌样瘤(Atypical Teratoid Rhabdoid Tumor，ATRT)发生率为百万分之8.1。ATRT是最常见的婴儿脑肿瘤之一，约占1岁以下儿童胚胎性脑肿瘤的40-50%，同时ATRT 也是一种及其凶险、很难治愈的儿童脑肿瘤。近期研究发现ATRT由3个分子亚群组成，分别被称为SHH、TYR和MYC。不同亚群具有不同的疾病模式和信号特征。

近日，多伦多儿童医院 Annie Huang 博士和 James T Rutka 博士领导的研究团队在 Neuro-Oncology 上发表了题为 A kinome drug screen identifies multi-TKI synergies and ERBB2 signaling as a therapeutic vulnerability in MYC/TYR subgroup ATRTs 的论文，研究人员利用ATRT亚群特异性细胞系对465个激酶抑制剂进行了药物敏感性筛选，并应用多组学分析研究了激酶抑制剂对ATRT细胞产生药效的潜在分子机制。

研究发现，ATRT 细胞系对靶向PI3K和MAPK信号通路以及CDK、AURKA/B激酶和PLK1的抑制剂广泛敏感。同时，MYC/TYR亚群的ATRT细胞对主要靶向受体酪氨酸激酶PDGFR和EFGR/ERBB2的多激酶抑制剂（MKIs）具有高度敏感性。通过联合用药研究、对ATRT亚群关键信号依赖性的分析以及体内外药效实验，研究人员证明，靶向PDGFR和ERBB2的酪氨酸激酶抑制剂（TKI）与PI3K和MAPK信号通路抑制剂联用是治疗ATRT MYC/TYR亚群的一种新的重要策略。同时，ERBB2信号通路是治疗ATRT MYC/TYR亚群的潜在靶点。

由于ATRT 细胞系在体外可以再现亚群特异性的信号依赖性，为研究和确定新的亚群靶向疗法提供了重要的替代模型。研究人员选取了亚群代表性高的细胞系，对465个激酶抑制剂进行了药物敏感性筛选。在药物筛选实验中，研究人员测定了不同药物浓度下ATRT细胞的存活率，由此计算EC50值，并对亚群选择性的抑制剂和广泛作用的抑制剂展开分析。需要指出的是，由于缺乏代表 TYR 的细胞系，且前期研究表明 TYR 和 MYC 亚群之间存在信号特征重叠，本研究中将 MYC 细胞称为 MYC/TYR细胞。

首先， 研究人员通过Welches T 检验，对不同亚群间每种抑制剂的 EC50 值进行了比较，分别发现了 10 种和 15 种在 SHH 和 MYC/TYR ATRT 细胞中EC50显著低于其他化合物的抑制剂。与前期研究一致，在MYC/TYR细胞中观察到 PDGFRB 信号抑制剂达沙替尼和尼洛替尼具有更低的平均 EC50值 。同时，MYC/TYR 细胞系对其他的广谱多激酶抑制剂（MKIs）也高度敏感，这些 MKIs 的靶点高度重合于受体酪氨酸激酶（RTK）家族，包括 FGFR, MET, KIT, FLT, KDR, EGFR和 ERBB2。另外，在 15个 MYC/TYR 特异性 MKIs 中有8个抑制 ErbB 家族成员，提示ATRT的生存可能依赖于 ErbB 信号。

由于观察到一组对不同 ATRT 细胞系具有广泛活性的抑制剂，研究人员猜测这些抑制剂可能作用于 ATRT 依赖的基本肿瘤维持途径。于是对6种不同ATRT细胞系中的EC50进行排序计算，发现药效排名靠前的化合物作用于PI3K/MTOR、MAPK信号通路、CDK、AURK激酶和PLK1。这些靶点已被研究证明与横纹肌样瘤和ATRT的生物学相关，这进一步支持了它们在驱动ATRT中的重要作用。

图1. 对激酶抑制剂的亚群特异性反应和广泛反应

随后，研究人员对ATRT广谱抑制剂进行了联合用药研究。此前，研究人员曾报道过达沙替尼可作用于 ATRT TYR 和 MYC亚群。在本研究中，达沙替尼对MYC/TYR细胞系的平均EC50也非常低，约为0.10 uM。进一步研究发现，达沙替尼虽然可以通过延长G1 期阻滞抑制MYC/TYR细胞增殖，但单独使用达沙替尼不足以诱导细胞凋亡。由于Western Blot分析发现治疗后磷酸化的 AKT (Thr308) 和磷酸化的ERK1/2 (Thr202/Tyr204) 上调，研究人员推断，在PDGFR 信号受到抑制的情况下，达沙替尼治疗后这些通路的激活可能促进了肿瘤细胞生存。这提供了一个合乎逻辑的共靶向通路，并促使研究者进一步研究与达沙替尼协同作用的可靶向肿瘤基本维持途径的广谱药物，以增强其疗效。

于是，他们评估了两种排名靠前的广谱药物雷帕霉素（排名1）和曲美替尼（排名4）作为潜在的组合药物。使用剂量对矩阵处理 BT-16 细胞系，并利用药物协同分析工具 BRAID对结果进行分析。研究人员发现，达沙替尼与雷帕霉素联用具有显著的协同作用，κ值为7.73。达沙替尼和曲美替尼的协同作用程度略低，κ值为3.89。这为协同靶向PDGFR和PI3K/MTOR或Ras/MAPK信号通路提供了有力的依据。

图2. 达沙替尼治疗可诱导细胞周期阻滞并与MTOR和MAPK信号通路抑制剂发挥协同作用

接下来，研究人员研究了ERBB2在MYC/TYR 细胞中的表达以及对MYC/TYR 细胞存活的作用。他们分别使用qRT-PCR 技术和基因表达阵列技术检测了ErbB 家族成员（EGFR、ERBB2、ERBB3和ERBB4）在 ATRT 细胞系和原发性ATRT中的表达。分析表明，MYC/TYR中 ERBB2 的表达显著高于 SHH 细胞系和原发 ATRTs。同时，ERBB2 蛋白表达仅在 MYC/TYR 细胞系中被检测到，这表明对 EGFR/ERBB2 抑制剂的敏感性可能由 ERBB2 介导。随后，研究人员用siRNA 敲低了ERBB2基因，并研究了ERBB2基因下调后ATRT细胞活率下降的原因。他们发现，ERBB2 缺失导致的细胞增殖缺陷很可能由对PI3K信号的调节所介导，而 ERBB2 表达并不影响 MAPK 信号。

图3. ERBB2在MYC/TYR ATRT中上调，只在MYC/TYR细胞系中表达，并对MYC/TYR生存至关重要

为了了解驱动ERBB2表达的因素，研究人员随后检测了原发性ATRT的全基因组测序（WGS）和从甲基化及SNP阵列获得的拷贝数数据，他们观察到ERBB2和其他ErbB家族RTK的突变和结构改变水平较低。这表明ERBB2异常表达并非由基因组变异引起。于是他们对驱动 ATRT 肿瘤生物学的转录异构体进行了研究。

对19 个肿瘤样本进行的 RNASeq 分析发现，原发ATRT 中存在两种 ERBB2 异构体。其中较短的异构在 MYC/TYR ATRT 中高度特异性富集，并且是 ATRT 中表达的主要异构体。这些发现表明，与 PDGFRB 一样，ERBB2 异构体在 ATRT 中的表达也可能受到表观遗传调控。接下来，为了研究ERBB2异构体特异性表达的潜在表观遗传调控，研究人员应用ATACSeq和H3K27Ac ChIPSeq以及RNASeq分析鉴定了可及的活性增强子并将其与ERBB2的表达状态相关联。图谱分析揭示了ERBB2上游的推测的5个远端增强子元件（EnhA-E），其中仅EnhE（预测其调控ERBB2的活性启动子）在MYC/TYR ATRTs中表现为特异性低甲基化和开放状态。此外，对 EnhE 区域的结合位点分析发现了多个与癌症通路有关的转录因子，这些因子在 MYC/TYR 中出现不同程度的上调。最后，在SHH和MYC/TYR细胞系上进行的针对H3K27Ac的邻位连接辅助ChIPSeq，进一步验证了EnhE与ERBB2启动子之间的相互作用，证明EnhE的表观遗传调控驱动了MYC/TYR ATRTs中ERBB2异构体的特异性表达。

为了将MYC/TYR ATRT 依赖 ERBB2 表达的研究结果转化成可行的疗法，研究人员重新筛选了6个可用于临床（至少处于3期临床试验阶段）的 ERBB2/EGFR 抑制剂子集，包括达可替尼、AE788、吉非替尼、阿法替尼、拉帕替尼和厄洛替尼。由于阿法替尼在MYC/TYR 细胞系中具有一致的高活性(EC50 = 0.02 μM-BT-16、0.02 μM-BT-12、0.01 μM-CHLA-06)，被选为进一步验证的对象。对阿法替尼治疗后的 ATRT 细胞进行增殖、凋亡和细胞周期分析以及定量Western Blot，发现阿法替尼能引起细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡，并抑制 PI3K 和 MAPK 信号转导。

最后，临床前药效学研究证明了阿法替尼在原位 ATRT 异种移植模型中能延长小鼠的生存期。颅内异种移植BT-16的 NSG小鼠从植入后第7 天开始连续 20 天接受阿法替尼（25 毫克/千克）或溶剂对照。与对照组（47 天）相比，接受阿法替尼治疗的小鼠中位生存期（56 天，P < 0.00009）明显延长。对植入BT-16后 30 天开始连续用阿法替尼（25 毫克/千克）或对照溶剂治疗 4 天的小鼠的异种移植物进行了免疫组化分析。结果显示，与对照组相比，阿法替尼治疗组小鼠的异种移植物中，ERBB2信号转导的下游靶点AKT苏氨酸308磷酸化减少, Ki67降低，caspase 3裂解的细胞数量增加。

图4. ERBB2/EGFR 抑制剂阿法替尼在ATRT原位异种移植模型中能延长小鼠生存期

总之，研究人员通过对465个激酶抑制剂的药敏性筛选和作用机制分析，发现了一种针对 MYC/TYR 亚型ATRTs 的有效联合疗法，并证明了ERBB2信号在MYC/TYR ATRTs中的关键作用。在临床前模型中，阿法替尼能有效靶向 ERBB2并延长异种移植瘤小鼠的生存期，为治疗MYC/TYR ATRTs提供了一种有希望的候选疗法。