经治进展期NSCLC基于胸腔积液cfDNA NGS检测可发现额外可靶向变异并揭示耐药机制，包括细胞学阴性患者

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肺癌患者在疾病进展过程中常出现胸腔积液。本研究评估胸腔积液上清cfDNA在鉴定既往治疗耐药的NSCLC患者中可靶向突变的应用价值。本项多中心回顾性研究，纳入95例接受至少一线治疗后疾病进展、并接受胸腔积液cfDNA二代测序（NGS）检测的患者。

初始常规分子检测在70例（73.7%）患者中检出多种驱动突变，26.3%患者未检出驱动突变。疾病进展期通过cfDNA NGS检出额外基因组变异，驱动突变检出率从73.7%提升至85.3%。在一/二代EGFR-TKI治疗后进展的患者中，40.7%出现获得性EGFR T790M突变，后续使用奥希替尼可获得临床获益。29例奥希替尼治疗后进展患者中，14例接受一线奥希替尼，15例接受二线奥希替尼。一线奥希替尼治疗患者中28.6%检出MET拷贝数增加（CNG），其与显著更短的PFS相关（12.0个月 vs 23.0个月，HR=18.68，P=0.00088）；MET和KRAS CNG与更差的总生存期相关。二线奥希替尼失败患者中，5例获得EGFR C797S突变，4例出现MYC CNG。MYC CNG与中位PFS缩短相关（8.5个月 vs 25.0个月，HR=8.4，P=0.0046）。

胸腔积液cfDNA取样是进展期NSCLC基因组分型的微创且高效方法，可为个体化治疗策略提供重要指导。

研究背景

靶向治疗的出现使二代测序（NGS）在NSCLC治疗中至关重要，因其可实现组织与血液样本的基因组分型。NGS在临床中广泛用于突变鉴定，但临床常面临组织样本不足等挑战。肿瘤不释放cfDNA导致外周血中无法检出，进一步限制了基于血液的NGS在部分肿瘤中的应用。

证据表明，在初诊NSCLC中，恶性胸腔积液（MPEs）cfDNA测序可作为组织与血浆的替代方案用于鉴定驱动突变。本队列优先选择胸腔积液上清cfDNA而非血浆ctDNA，因其直接反映胸腔内局部肿瘤释放情况，并减少低释放肿瘤的血浆假阴性结果。既往研究证实，胸腔积液上清cfDNA的突变检出率高于血浆，可发现血液检测遗漏的驱动与耐药变异，包括细胞学阴性积液。与既往胸腔积液液体活检研究一致，本研究检测物称为胸腔积液cfDNA（胸腔积液上清来源的肿瘤DNA）。通过体细胞变异与变异等位基因频率进行生物信息学鉴定肿瘤来源片段。该方法可无需侵入性组织活检即可开展突变分析，尤其适用于高风险或肿瘤难以获取的患者。尽管靶向治疗是伴驱动突变晚期NSCLC的标准一线治疗，但患者预后仍较差，原因是靶向药物获得性耐药，常伴随MPE发生。

本研究聚焦MPE样本在既往治疗耐药NSCLC患者中的应用价值，旨在评估对该类患者MPE样本cfDNA行NGS检测以鉴定驱动突变与耐药机制的可行性。研究结果为耐药NSCLC患者基因分型提供实用、微创方案，支持个体化治疗策略。所有患者在初诊时均使用诊断组织或胸腔积液细胞蜡块行常规序贯分子检测，具体包括EGFR RT-PCR、ALK免疫组化（IHC）、ROS1荧光原位杂交，以检测热点驱动突变。初诊时常规检测（含EGFR Cobas检测、ALK IHC、ROS1荧光原位杂交）阴性的患者，由主治医生与患者共同决策后，使用肿瘤组织或血浆行NGS检测。本研究中“多重打击”定义为NGS panel中同一基因内≥2个明确致病或可能致病突变（EGFR除外）。EGFR变异单独展示，意义未明变异不计入打击数。

研究结果

患者基线特征：

2021年12月至2024年6月，共纳入95例转移性NSCLC患者，均接受至少一线系统治疗后疾病进展。患者特征见表1。中位年龄66岁（范围36-88岁），女性57例（60.0%）。腺癌为最常见组织学类型（n=91，95.8%）。初诊常规分子检测检出的驱动突变：EGFR 19外显子缺失（n=36，37.9%）、EGFR L858R突变（n=22，23.2%）、罕见或复合EGFR突变（n=4，4.2%）、EGFR 20外显子插入（n=2，2.1%）、ALK融合（n=3，3.2%）、ROS1融合（n=3，3.2%）。总计25例（26.3%）常规检测未检出致癌驱动突变。胸腔积液cfDNA检测前，27/95（28.4%）患者接受一/二代EGFR-TKI，14/95（14.7%）接受一线奥希替尼，15/95（15.8%）接受二线奥希替尼（表1）。所有95例患者影像学证实进展时伴胸腔积液。54例（56.8%）患者行胸腔积液样本肿瘤细胞分析，其余病例无可用细胞蜡块行进一步细胞分析。超过半数胸腔积液肿瘤细胞占比<5%（n=34，55.7%）或结果阴性（n=7，7.4%）。胸腔积液上清cfDNA中位浓度4.29ng/μl（范围0.018-567.923ng/μl）。高、低胸腔积液细胞样本间DNA浓度无显著差异。

表1

疾病进展后胸腔积液上清cfDNA NGS检测：

除初诊检出的70个致癌驱动突变外，胸腔积液样本中额外检出5个EGFR突变与6个其他驱动突变。95例患者瀑布图见图1。新检出EGFR突变包括EGFR L858R+K860I、L858R、19外显子缺失、A864V、20外显子插入。其他检出突变包括KIF5B-RET融合、SND1-BRAF融合、ERBB2 20外显子插入、KRAS G12A、KRAS G12V、PIK3CA E454K。这些突变归为可靶向或潜在可靶向突变。驱动突变检出率从初诊73.7%（70/95）提升至随访分析85.3%（81/95）。

图1

一/二代EGFR-TKI治疗后疾病进展：

总计27例（28.4%）患者在一/二代EGFR-TKI一线治疗后疾病进展，行胸腔积液上清NGS检测。该组患者瀑布图见图2A。27例EGFR突变患者中，11例（40.7%）出现获得性EGFR T790M突变，为一/二代EGFR-TKI最常见耐药形式。图2B展示潜在获得性耐药机制，最常见变异为EGFR T790M、PIK3CA错义突变、MET CNG。本研究中11例获得性EGFR T790M突变患者，中位随访6个月，奥希替尼治疗后中位PFS尚未达到。

图2

一线/二线奥希替尼治疗后疾病进展：

总计29例一线（n=14）或二线（n=15）奥希替尼治疗后疾病进展患者，行胸腔积液上清NGS检测（图3A）。14例一线奥希替尼患者均未出现获得性EGFR T790M突变。一线奥希替尼潜在耐药基因组变异见图3B，最常见为MET CNG（28.6%）。

图3

伴MET CNG患者一线奥希替尼治疗中位PFS更短（12.0个月 vs 23.0个月，HR=18.68，P=0.00088），见图4A Kaplan-Meier曲线与图4B游泳图。伴MET与KRAS CNG患者一线奥希替尼治疗后总生存期更差，见图4C Kaplan-Meier曲线。

图4

15例二线奥希替尼失败患者中，5例获得EGFR C797S突变（均与T790M顺式存在），为最常见耐药机制（图3B）。此外，4例患者出现MYC CNG，其与二线奥希替尼治疗中位PFS显著缩短相关（8.5个月 vs 25.0个月，HR=8.4，P=0.0046）。

无可靶向突变患者：

总计17例患者未检出驱动突变，系统化疗后疾病进展。疾病进展后胸腔积液上清NGS检测检出3例致癌驱动突变：2例KRAS G12X突变、1例PIK3CA E545K突变。PIK3CA激活突变在无其他可靶向驱动变异患者中潜在可治疗；1例病例报告显示PIK3CA H1047R突变患者对阿培利司治疗应答。TP53突变为最常见基因变异，发生率64.7%。

讨 论

本研究探讨胸腔积液上清cfDNA在既往治疗后NSCLC患者中鉴定可靶向基因组变异的潜力。并非所有患者治疗前均行NGS，25例（26.3%）患者初诊未检出驱动突变。疾病进展后NGS额外检出11.6%驱动突变，部分为可用药突变。新检出变异主要因早期单基因检测方法学局限，在基线同一基因野生型患者中发现，如EGFR L858R+K860I、A864V、20外显子插入未被临床常规Cobas EGFR RT-PCR热点panel覆盖。同理，KIF5B-RET、SND1-BRAF融合、ERBB2 20外显子插入、KRAS G12A/G12V、PIK3CA E454K等融合与突变因超出常规临床检测范围，初诊未评估。因此，进展期胸腔积液cfDNA NGS可发现这些额外可靶向或潜在可靶向变异。因所有新检出变异患者仅接受化疗±免疫治疗，未接受既往靶向治疗，这些变异归为驱动突变而非耐药突变。

胸腔积液上清cfDNA分析比血浆cfDNA分析更敏感，血浆cfDNA受肿瘤负荷低或肿瘤不释放限制。本研究中62.9%胸腔积液肿瘤细胞占比<5%，13%细胞学阴性，但85.3%病例检出致癌驱动突变。该结果与另一项研究一致，即胸腔积液上清cfDNA突变检测敏感性高于胸腔积液沉淀细胞基因组DNA，尤其细胞学阴性样本。

EGFR-TKI或ALK抑制剂治疗后胸腔积液cfDNA可靶向基因组变异与耐药机制数据有限。一项多中心研究显示，胸腔积液cfDNA比临床研究与实践常用血浆cfDNA提供更相关基因组信息。吉非替尼或厄洛替尼获得性耐药患者中50%-60%检出T790M突变，阿法替尼耐药患者中47.6%检出。本队列27例一/二代EGFR-TKI治疗患者中，40.7%出现T790M突变，通过胸腔积液上清cfDNA检出。

AURA3研究中，一线EGFR-TKI治疗后获得T790M突变的晚期NSCLC患者，奥希替尼治疗PFS长于铂类化疗（10.1个月 vs 4.4个月，HR=0.30，95%CI 0.23-0.41，P<0.001）。本研究中11例获得性EGFR T790M突变患者，中位随访6个月，奥希替尼治疗后中位PFS尚未达到，与AURA3研究结果一致。一/二代EGFR-TKI进展后其他常见基因变异为PIK3CA激活错义突变与MET CNG，这些获得性耐药机制与FLAURA研究中吉非替尼、厄洛替尼等对照EGFR-TKI治疗患者一致。

奥希替尼治疗患者PFS长于其他一代EGFR-TKI，确立奥希替尼为初治EGFR突变晚期NSCLC首选标准治疗。但奥希替尼最终会出现耐药，治疗失败机制各异。本研究通过一线/二线奥希替尼治疗后胸腔积液上清cfDNA获得的耐药机制结果，与FLAURA、AURA3研究一致。这些研究发现获得性EGFR突变（如C797S）、MET与ERBB2扩增、小细胞转化等。

一线奥希替尼治疗后，胸腔积液cfDNA显示耐药原因为MET CNG，其与奥希替尼中位PFS缩短（12个月）相关。INSIGHT 2研究纳入一线奥希替尼治疗后伴MET扩增耐药的EGFR突变NSCLC患者，其中位PFS为15.4个月（四分位距10.3-22.5个月），短于FLAURA研究报道的18.9个月。此外，FLAURA研究耐药分析亚组中，耐药机制类型与奥希替尼或对照EGFR-TKI治疗时长无明确相关性，但奥希替尼组15例获得MET扩增患者中11例治疗时长最短。本研究中MET CNG通过胸腔积液cfDNA靶向NGS深度比值推断，与FISH或液体NGS定义的MET扩增（如MET/CEP7比值≥2.0、绝对基因拷贝数≥5或液体活检二代测序血浆MET基因拷贝数≥2.3）方法学不同。因此，本结果解读为CNG相关信号，而非FISH证实扩增。

奥希替尼耐药机制在一线与二线治疗场景中存在差异。MET扩增是一线场景常见耐药机制，C797S突变在一线场景少见、二线场景更常见。本研究15例二线奥希替尼失败患者中，33%（5例）出现EGFR C797S突变，与T790M顺式存在。新型四代EGFR-TKI目前正在研发以应对T790M与C797S突变耐药。

本研究结果还显示，二线奥希替尼治疗后检出MYC CNG的患者，奥希替尼治疗PFS更短。MYC CNG与多种TKI耐药相关，靶向MYC药物正在临床研究中。

本研究存在若干局限性。首先，尽管回顾性设计基于大样本多中心数据，结果仍需前瞻性研究详细数据与编码进一步验证。其次，尽管95例患者中51例（53.7%）在初诊或治疗进展前行NGS，但使用不同样本类型（血液/组织）与平台，对耐药机制定义存在挑战。第三，台湾全民健康保险不覆盖NGS检测，NGS使用决策可能受患者社会经济状况与医生经验影响。最后，NGS最佳时机、平台选择、转移灶取样部位选择仍存争议。

综上，本研究证实胸腔积液上清cfDNA基因组分型在既往治疗转移性NSCLC患者中鉴定可靶向突变的应用价值。该方法可检出常规分子检测未捕获的可用药突变，同时揭示潜在耐药机制，提示治疗后基因组分型策略可助力便捷可靠的临床治疗方案。研究结果支持胸腔积液cfDNA NGS作为进展期常规检测补充的可行性与临床应用价值，本观察为假说生成性，需大样本、预设生存终点的前瞻性研究验证。

参考文献：

Chang SC, Huang CY, Lai YC, et al. Clinical utility of pleural effusion supernatant cell-free DNA genotyping in previously treated patients with advanced non-small-cell lung cancer and disease progression: a multicenter retrospective study. ESMO Open. 2026;11(1):106023. doi:10.1016/j.esmoop.2025.106023