临床实例：RNA NGS检测助力免疫组化结果不明确的儿童尤因肉瘤/透明细胞肉瘤临床诊断

骨与软组织肉瘤包含超过 70 种组织学亚型，由于特征重叠而带来诊断挑战。分子检测（如荧光原位杂交[FISH]和逆转录聚合酶链式反应[RT-PCR]）有助于识别特定的基因组改变，但往往存在局限性，尤其是在先前的组织学结果不确定时。下一代测序（NGS）通过靶向测序panel提供高通量检测，可解决这些局限性。本病例系列强调了NGS在诊断两名免疫生物学上不明确的尤因肉瘤（ES）和透明细胞肉瘤（CCS）儿童患者中的实用性，突出了其作为实体瘤诊断强大工具的价值。

背 景

肉瘤是一类异质性的间充质肿瘤，起源于骨骼和软组织（包括结缔组织、肌肉、神经、血管和脂肪）。它们占所有儿科实体恶性肿瘤的 13%–20%。许多软组织和骨肉瘤具有侵袭性，导致癌症相关的死亡和发病。虽然最常见的儿科肉瘤是横纹肌肉瘤、骨肉瘤和尤因肉瘤（ES），但已有超过 70 种组织学亚型被描述。由于临床、组织学和免疫组化特征重叠，肉瘤的诊断具有挑战性，这使得亚型间的鉴别复杂化。

分子检测（如逆转录聚合酶链式反应[RT-PCR]、荧光原位杂交[FISH]以及最近的下一代测序[NGS]）在提高肉瘤诊断准确性方面发挥了关键作用。近年来，由于周转时间缩短和成本降低，NGS在癌症研究和医院环境中的应用日益增加。在骨与软组织肉瘤领域，NGS能够快速识别多种分子变异，包括在沉默基因组背景下的疾病特异性易位、扩增和突变。文献中出现的病例表明，NGS在识别具有复杂形态学和免疫表型特征的实体瘤方面具有实用性。

尽管NGS具有强大的诊断潜力，但它在临床环境中仍未得到充分利用，尤其是在实体瘤诊断方面，这一点从文献中报道的有限病例中可见一斑。在本病例系列中，我们强调了NGS在准确诊断两名组织学和免疫生物学上不明确的软组织肿块儿科患者中的成功应用，最终指导了疾病特异性的治疗管理。

病例1

患者男，16 岁，无明显既往病史，因右下肢疼痛伴肿胀 6 个月就诊。X线检查显示右胫骨近端存在混合性硬化和溶骨性病变。磁共振成像（MRI）显示右胫骨近端内有一个大的分叶状肿块，延伸至邻近的右胫前肌和胫后肌，大小为 10.7×10.0×7.2 cm（图1a）。胸部计算机断层扫描（CT）未见肺部受累，但正电子发射断层扫描（PET）显示肿瘤广泛转移至邻近肌肉组织及盆腔远处淋巴结。活检显示低分化小圆细胞肉瘤，BCL-6共抑制因子（BCOR）、CD99、友白血病病毒整合位点1（FLI1）和分裂转导样增强子1（TLE1）呈阳性（图1b）。细胞NKX2.2呈阴性，提示为BCOR::CCNB3型尤因样肉瘤（ELS）。然而，基于RNA的下一代测序（NGS）结果显示，存在EWS RNA结合蛋白1（EWSR1）与FLI1的特征性融合，证实了尤因肉瘤（ES）的诊断。该患者因不适合手术，根据儿童肿瘤学组AEWS1221方案接受了 8 个周期的化疗，并以 55.8 Gy（共分割为 31 次）质子束治疗作为局部控制。治疗结束时的影像学检查显示无活动性疾病，但治疗后 28 个月的最新扫描显示远处转移，患者目前正在接受治疗。

▲图1 初诊时的MRI和HE染色结果

病例2

患者男，18 岁，无既往病史，右上肢及右手疼痛时轻时重已 4 年，右腋窝肿块 1 年。磁共振成像（MRI）显示右腋窝有一个圆形肿块，大小为 4.6×4.2×4.4 cm，伴瘤周水肿和强化，但无中央强化（图2a）。右上肢计算机断层扫描血管造影（CTA）显示肿块与右腋动脉分离，毗邻腋窝、胸肌和胸外侧椎分支，无包膜。胸部CT未见肺部受累。患者接受了右腋窝肿瘤切除术，但因肿瘤与臂丛神经粘连，5%–10% 的肿瘤组织被认为无法切除。组织学评估显示肿块边界清晰，中央有囊性出血改变，伴明显慢性炎症，含大量含铁血黄素、血铁素和硬化。肿瘤细胞大，呈多角形，片状或簇状排列，胞质丰富透亮（图2b）。细胞表达泛角蛋白、角蛋白AE1/AE3、SOX10和S100，不表达HMB45和MelanA（图2c）。荧光原位杂交（FISH）检测到EWSR1相关重排，提示可能为透明细胞肌上皮瘤或透明细胞肉瘤（CCS）。然而，形态学特征和免疫组化结果对这两种可能性均不典型。基于RNA的下一代测序（NGS）显示存在EWSR1（22q12.1）与ATF1（12q13.12）基因座融合，证实诊断为透明细胞肉瘤（CCS）。因此，患者接受了二次手术，以完整切除肿瘤肿块并对周围腋窝淋巴结进行清扫。切缘阴性，未观察到淋巴结受累。二次手术后随访MRI显示原切除区域无复发病灶。鉴于患者已完全切除肿瘤且无晚期病变，未推荐辅助治疗。患者每 3 个月进行一次疾病监测，自切除以来约一年无疾病证据。

▲图2 初诊时的MRI、HE和免疫组化结果

讨 论

病例1代表了组织学上不明确的尤因肉瘤（ES）诊断，最初被误判为尤因样肉瘤（ELS），直到下一代测序（NGS）确认了特征性的ES融合基因。ES和ELS均为高度侵袭性的间充质肿瘤，主要影响儿童和青年人群。2020 年，世界卫生组织（WHO）将ES和ELS新归类为未分化小圆细胞肉瘤。由于组织学特征相似，免疫染色和分子谱分析等先进诊断工具对于准确区分这些亚型至关重要。

在儿童中，ES是第二常见的原发性恶性骨肿瘤，主要累及长骨的干骺端，其次是骨盆、肋骨和椎骨。其特征是EWSR1基因与其他融合伙伴（最常见为FLI1基因）融合。ES细胞呈单一形态、圆形、高分裂活性，且CD99强阳性、NKX2.2阳性、TLE1阴性。当前治疗方案包括密集化疗联合手术和/或放疗的局部控制。相比之下，ELS缺乏ES特有的EWSR1基因融合，但在不同ELS亚型中已发现其他融合和分子变异。其中一种亚型——BCOR-CCNB3肉瘤（BCS）常见于骨盆、下肢和脊柱旁区域。组织学上，BCS包含圆形和梭形细胞混合，且CCNB3阳性、BCOR阳性、CD99弱阳性。BCOR::CCNB3重排占BCS中BCOR基因改变的 60%。与ES相比，BCS的临床病程更惰性。

BCS和ES重叠的组织学及临床特征可能导致诊断困难。在Puls等人的研究中，70%的BCS病例表现出与ES相似的小原始细胞形态，60%的病例免疫组化显示CD99阳性。在我们的患者病例中，肿瘤由小圆细胞组成，且CD99阳性、BCOR阳性、FLI1阳性、TLE1阴性、NKX2.2阴性。虽然CD99和FLI1是ES常见的免疫组化标志物，但缺乏特异性。NKX2.2作为EWSR1::FLI1融合基因的下游靶点，已成为ES高度敏感的免疫组化标志物。Russell-Goldman等人报道，NKX2.2对ES的敏感性为100%，且因其TLE1阴性有助于区分滑膜肉瘤。若没有NGS的辅助，我们的患者会被误诊为BCS——尽管目前BCS采用ES方案治疗，但其总体预后更良好。

病例2展示了NGS在确认透明细胞肉瘤（CCS）模糊诊断中的作用。CCS是一种软组织肉瘤，主要影响成人，中位年龄为 39 岁，青少年和青年人群极少受累。CCS最常见于下肢，但罕见情况下也可累及头颈部、上肢、胸壁和内脏器官。大体上，CCS表现为坚实的棕灰色肿块。组织学上，CCS起源于神经嵴细胞，与恶性黑色素瘤具有相似的形态特征：两者均含有因糖原积累而胞质透亮的多边形和梭形细胞，以及中央圆形核。CCS细胞通常表达HMB45和S100，也可能CD99、MelanA、神经特异性烯醇化酶和波形蛋白阳性，而细胞角蛋白、上皮膜抗原、癌胚抗原、结蛋白和平滑肌肌动蛋白通常阴性。大多数CCS病例存在t(12;22)(q13;q12)易位，导致EWSR1::ATF1基因融合——这是区分CCS与恶性黑色素瘤的关键特征。本文病例有几个CCS不典型特征：年龄较轻（18 岁）、肿瘤位置（右上肢）、组织学特征（中央囊性出血改变的肿块）和免疫组化特征（泛角蛋白阳性、AE1/AE3阳性、S100阳性、HMB45阴性、MelanA阴性）。NGS检测到特征性的EWSR1::ATF1基因融合，解决了诊断模糊的问题，实现了明确诊断和及时治疗。这一点至关重要，因为CCS具有高度浸润性和高转移潜力。

NGS越来越被视为肉瘤诊断的“分子显微镜”，因为许多肉瘤表现出形态异质性和模糊的免疫组化谱。分子生物学的进展推动了癌症研究的发展。在Italiano等人的观察性研究中，肉瘤专家病理学家的组织学诊断与基于基因组杂交、FISH和RT-PCR的诊断进行了比较。在 384 例肉瘤病例中，分子检测改变了 53 例的诊断和治疗计划。Mathias等人报道了一例低分化小圆细胞肉瘤，FISH显示EWSR1基因重排，免疫组化CD99阳性，最初提示为ELS。然而，NGS显示其基因组复杂，缺乏特征性的EWSR1相关重排，反而发现RB1、PTCH1和ATRX缺失，最终确诊为骨肉瘤。在另一病例中，Doyle等人使用NGS重新分类了最初诊断为非典型类癌的肺部非典型肿块，检测到EWSR1::ERG染色体易位，修正诊断为ES（肺部极罕见）。

NGS通过实现DNA和RNA片段的高通量测序，革新了生物医学领域。在临床实践中，靶向NGS panel比全基因组测序更常用。NGS优于传统分子检测（如FISH和RT-PCR）——后者每个反应仅分析一个基因。相比之下，NGS可同时检测多个基因，减少所需的组织和遗传物质。对于具有多个突变或病理不确定的肿瘤，用FISH和RT-PCR检测所有可能的改变是不切实际的。而NGS可对数十或数百个基因进行靶向测序，显著提高诊断准确性。此外，转录组水平的基于RNA的NGS能检测FISH、RT-PCR和基于DNA的NGS无法检测的基因融合和罕见基因组异常。例如，如我们的病例和其他研究所示，使用融合特异性探针的NGS分析可区分小圆细胞肉瘤标本中的ES和ELS。

尽管NGS诊断效用巨大，但仍成本高昂，且常无法现场检测。此外，其周转时间（通常为几周）比显微镜评估、免疫组化和其他分子研究更长。随着更多癌症相关基因和易位被发现，NGS诊断平台将通过扩展靶向测序panel变得更准确、高效和经济。除诊断能力外，NGS还为精准肿瘤学铺路，基于肿瘤分子特征促进患者特异性靶向治疗。其他应用包括识别治疗耐药的分子机制和驱动肿瘤发生的复发突变——这可极大影响复发癌症的管理。

总之，在本系列病例中，研究人员描述了尤因肉瘤（ES）和透明细胞肉瘤（CCS）的两种罕见临床表现——若没有下一代测序（NGS）分析，这些病例可能会被误诊并存在潜在误治可能。精准诊断具有重要的预后和治疗意义。本病例系列强调了NGS在准确诊断组织学和免疫组化上不明确的软组织肿块中的作用。应鼓励儿童肿瘤医生将NGS纳入软组织肿块的初始诊断评估，尤其是当临床、组织学和免疫组化特征与明确诊断不符时。

参考文献：

He, Chong & Pham, Dan & Kronenfeld, Rachel & Rosenberg, Andrew & Ardente, Jessica & Dhir, Aditi. (2025). The Importance of Next‐Generation Sequencing in Identifying Immunohistochemically Ambiguous Pediatric Sarcomas. Case Reports in Oncological Medicine. 2025. 10.1155/crom/9926653.