CAR-DC联合CAR-T治疗复发难治AML的研究进展和未来方向

急性髓系白血病（AML）仍然是成人中最常见的白血病类型。尽管常规疗法取得了进展，但高复发率依然存在，凸显了对嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞疗法等新方法的需求。靶向C型凝集素样分子-1（CLL1）的CAR-T成为治疗复发/难治性（R/R）AML的一种有前景的方法，然而，虽然约70%的患者获得缓解，但仅有一部分达到微小残留病（MRD）阴性缓解，仍有很大提升空间。CLL1 CAR-T细胞疗法失败的主要原因包括：（1）由于抗原逃逸，CLL1阴性的AML细胞持续存在；（2）免疫抑制性肿瘤微环境（TME）导致白细胞介素（IL）-12等细胞因子下调，导致内源性T细胞和CLL1 CAR-T细胞耗竭。

因此天津市第一中心医院赵明峰教授团队提出，可将CAR修饰的树突状细胞（CAR-DCs）与CLL1 CAR-T细胞联合使用，以克服当前的局限性。CAR-DCs通过增强抗原交叉呈递来激活内源性T细胞以对抗抗原阴性克隆，分泌免疫刺激性细胞因子（如IL-12）以维持CAR-T活性，并重塑TME。关键挑战包括优化CAR设计（例如，整合Fms样酪氨酸激酶3配体[FLT-3L]或CD40信号域）、减轻毒性以及建立临床给药方案。

赵明峰教授团队近日于《Clinical and Translational Medicine》发表综述，重点讨论了限制靶向CLL1的CAR-T细胞疗法在R/R AML中疗效的具体挑战，即抗原逃逸和TME，并提出了一种CAR-DCs与CLL1 CAR-T细胞联合的新型策略作为缓解这些障碍的有前景的方法，还审视了该协同策略的理论基础、当前研究进展和未来展望。

本文亮点

• 作者开展的早期临床试验表明，靶向C型凝集素样分子-1（CLL1）治疗难治性/复发性急性髓系白血病（AML）的有效性已得到验证，但仍存在相当大的改进空间。

• 作者总结了关于树突状细胞（DC）疗法和嵌合抗原受体修饰的DC（CAR-DC）疗法的临床试验和基础研究。

• 作者探讨了CLL1 CAR-DC细胞联合CLL1 CAR-T细胞在AML中的协同机制和前景。

急性髓系白血病治疗的当前研究现状

急性髓系白血病（AML）的常规治疗主要包括化疗、靶向治疗和造血干细胞移植，但大多数患者面临复发风险。嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞疗法是治疗复发/难治性（R/R）AML的一种有前景的新方法，尽管仍面临重大挑战。目前，通过靶向CD19、CD22和B细胞成熟抗原（BCMA），CAR-T细胞疗法在急性淋巴细胞白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤等血液恶性肿瘤中取得了令人印象深刻的临床结果。然而CAR-T细胞疗法在AML中临床上仍不成熟，现有研究的总体疗效有限，主要原因包括缺乏特异性靶点、免疫抑制性肿瘤微环境（TME）和抗原逃逸。早期的AML CAR-T疗法靶向CD33和CD123，但其毒性或疗效不佳限制了其临床应用，其他潜在靶点包括C型凝集素样分子-1（CLL1）、FLT3、NKG2D、CD7、CD38等。靶向CLL1的CAR-T细胞在治疗R/R AML中已显示出有前景的疗效。

CLL1 CAR-T细胞在复发/难治性AML中的治疗效果

CLL1是一种C型凝集素样受体，在白血病干细胞（LSCs）（约45%）和白血病祖细胞（77.5%–92%）上高表达。Tashiro等人开发了第一个CLL1 CAR-T细胞，能够选择性杀伤白血病祖细胞和白血病细胞，CLL1 CAR-T细胞在体外和小鼠体内均显示出卓越的AML杀伤能力。一份病例报告描述了一名10岁患者在CLL1 CAR-T治疗后达到完全缓解（CR）。作者课题组也报道了10名接受CLL1 CAR-T细胞治疗的成年AML患者，其CR率达到70%。

目前共有48名患者接受了CLL1 CAR-T细胞治疗。所有患者在输注后第14至16天之间进行了疗效评估，34名患者（70.83%）达到CR，其中13名为微小残留病（MRD）阳性CR，21名为MRD阴性CR；其余14名患者（29.17%）对治疗无反应。不良事件方面，细胞因子释放综合征（CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）的发生率分别为95.83%和20.83%，严重（3/4级）CRS和ICANS分别为41.67%和10.42%。血液学毒性是最常见的并发症，白细胞减少、粒细胞减少、贫血和血小板减少的发生率几乎普遍。值得注意的是，严重且持久的粒细胞减少显著增加了感染并发症的风险。在报告的感染中，38名患者经历了细菌感染，而病毒和真菌感染分别发生于9名和10名患者。比较分析进一步显示，与轻度CRS（1/2级）患者相比，严重CRS（3/4级）患者表现出更明显的细胞因子释放，特别是白细胞介素（IL）-2、IL-6、IL-10、C反应蛋白和铁蛋白水平升高。

尽管靶向CLL1的CAR-T细胞在R/R AML中显示出临床疗效，但约30%的患者表现出原发性治疗耐药。此外只有50%的应答者达到MRD阴性缓解，从而凸显了增强治疗策略的必要性。

其主要局限性包括以下几点：（1）抗原逃逸——低表达CLL1的AML细胞难以被CAR-T细胞识别，并且复发患者常出现靶抗原弱表达。（2）TME和IL-12——TME通过髓源性抑制细胞（MDSCs）、调节性T细胞（Tregs）和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）降低CAR-T细胞的疗效。细胞因子失调（包括IL-12）进一步损害CAR-T细胞功能。值得注意的是，具有可诱导IL-12分泌和T细胞受体（TCR）敲除（KO）的mKRAS特异性NeoCARs在体内表现出强大的抗肿瘤活性和良好的安全性。CAR共表达IL-12和干扰素-γ（IFN）α2可增强促炎微环境并减轻T细胞耗竭。此外，mbIL-12修饰的CAR-T细胞在克服TME方面已证明安全有效。

IL-12不仅能增加CAR-T细胞的细胞毒性，还能通过增加促炎性CD4+ T细胞浸润、减少Tregs和激活髓样细胞来重塑TME，在多形性胶质母细胞瘤靶向CAR-T细胞疗法中全身毒性最小。因此，结合CAR-T修饰和TME重塑的综合策略对于改善CLL1 CAR-T细胞疗法的临床结果至关重要。

树突状细胞和CAR修饰的树突状细胞疗法的研究进展与挑战

树突状细胞（DCs）通过吞噬肿瘤物质、处理肿瘤抗原并将肽-主要组织相容性复合体（MHC）复合物呈递给T细胞来激活肿瘤特异性T细胞，从而调节抗肿瘤免疫。成熟DCs通过共刺激分子（CD80/CD86）直接与T细胞接触，分泌IL-12并启动内源性肿瘤特异性T细胞的初次激活。成熟DCs可通过从肿瘤迁移到淋巴结、捕获抗原并激活初始T细胞来触发肿瘤特异性CD8+ T细胞免疫。

常规树突状细胞（cDCs）分为两个主要亚群：1型（cDC1）和2型（cDC2）。cDC1s在引流淋巴结（dLNs）中启动CD8+ T细胞，并激活Toll样受体诱导IL-12p70和IFN-α，促进Th1型免疫，其的存在与癌症患者的良好预后相关。cDC2s比cDC1s更丰富，表达CD11c、CSF-1R、MHC-II、CD11b、BDCA1和SIRPα，产生多种细胞因子，如IL-23和IL-10，并将抗原呈递给CD4+辅助T细胞，激活Th2和Th17亚群。已发现的新DC亚群包括LAMP3+ DCs和AXL+SIGLEC6+（AS）DCs。研究描述了骨髓和血液中的DC前体，显示出共享和独特的调控网络，并提示前体DC内存在反映早期谱系偏好的潜在异质性。

单细胞和批量RNA测序揭示了免疫抑制性CCL22+ DCs的富集，称为“耗竭DCs”，它们可被中药方剂SBJDD及其成分小檗碱逆转；TMEM131介导的肿瘤坏死因子（TNF）信号通路促进了CCL22+ DC的发育，并被小檗碱抑制。谱系追踪显示DC3s来源于单核细胞-DC祖细胞，通过Lyz2+Ly6C+CD11c-前体，与DC2谱系不同，表明DC3是一个独立的谱系，在表型上与单核细胞相关，但在发育上独立。脓毒症的单细胞RNA测序揭示了主要的免疫细胞变化和一个具有成熟、迁移和免疫调节特征的独特cDC亚群，与mregDCs一致；这个脓毒症诱导的mregDC亚群得到验证，并被证明可以激活初始CD4+ T细胞，同时促进Tregs分化。

功能状态取决于成熟度：成熟DCs表达高水平的MHC和共刺激分子（如CD80/86），并促进效应T细胞活化，而未成熟DCs通常诱导Tregs和免疫耐受。肿瘤损害DC成熟以逃避免疫。在AML中，DC的频率和功能常常受损，导致疾病进展和治疗抵抗。cDC1s在体内特异性执行抗原交叉呈递，对于适应性抗肿瘤免疫至关重要；没有cDC1，肿瘤会逃避免疫清除。由于其卓越的T细胞激活和交叉呈递能力，cDC1是基于CAR-DC的免疫疗法的首选亚群。

DC/肿瘤融合疫苗或负载肿瘤裂解物的DCs可以激活并维持抗肿瘤T细胞反应，并扩增肿瘤特异性T细胞克隆。一项II期临床试验（NCT03059485）显示，在老年AML患者中，不使用维持治疗的DC/AML融合疫苗接种导致73%的2年总生存率和36%的无进展生存率。Eps8-DCs可增强CD19 CAR-T功能，增加细胞因子、CD107a脱颗粒和细胞毒性。然而，DC功能障碍导致免疫逃逸，并限制了DC疫苗在老年患者中的疗效。临床moDC疫苗的疗效仍然变化较大，受到抗原负载挑战、不完全成熟和肿瘤异质性的限制。IL-12分泌直接影响内源性DC1功能。cDC疫苗面临显著局限性，包括DCs功能障碍（尤其在老年人中）、由于抗原负载挑战和不完全成熟导致的疗效差且多变，以及对肿瘤异质性的易感性。这些局限性凸显了对CAR-DC平台等先进策略的需求。

TME通过多种抑制机制损害DC功能，包括：（1）诱导DC凋亡，（2）抑制DC成熟和抗原呈递，（3）促进耐受性DC表型，和（4）下调DC招募趋化因子以限制肿瘤浸润。

鉴于功能性DCs的关键作用及其在AML中的脆弱性，重编程或使DCs“ rejuvenate（恢复活力）”的策略已成为一个关键的研究重点。DC生长因子Fms样酪氨酸激酶3配体（Flt3L）通过扩增和激活DC群体来增强T细胞介导的抗肿瘤免疫。高度活化的DCs可以诱导老年小鼠的CD4⁺ T细胞获得细胞毒性和抗肿瘤功能。PU.1-、BATF3-和IRF8介导的DC重编程减少耗竭，并增加记忆和干细胞样T细胞浸润。在cDC1中敲除BCL9/BCL9L可增强CD8⁺  T细胞活化、抗原呈递、表位扩展并促进抗肿瘤活性。尽管已经开发出有前景的方法，如Flt3L扩增和通过PU.1、BATF3和IRF8进行转录重编程，但DC重编程仍面临相当大的挑战。关键局限性包括小鼠模型与人类患者之间的转化差距、在临床环境中控制遗传或转录程序的难度和安全问题，以及重编程状态在免疫抑制性TME中的不稳定性。

此外，CAR-DCs可以特异性识别肿瘤抗原，有效吞噬CAR靶向的肿瘤细胞和碎片，随后激活内源性肿瘤特异性T细胞反应。抗肿瘤T细胞反应可以直接消除CAR靶向的抗原阳性肿瘤，并通过交叉呈递和表位扩散间接消除抗原阴性肿瘤（这些肿瘤不被CAR直接识别）。活化的CAR-DCs分泌免疫刺激性细胞因子，如IL-12。CAR的细胞内信号域在肿瘤识别期间可以保持持续激活，使DCs能够维持稳态并抵抗抑制性微环境，让耐受性DCs重新适应。

CAR-DCs克服抗原逃逸并靶向CAR抗原阴性细胞的机制基于其独特的抗原交叉呈递和随后的表位扩散能力。（1）吞噬抗原阳性细胞：CAR-DCs利用其CAR特异性识别并吞噬CAR阳性（例如CLL1⁺）AML细胞。（2）交叉呈递和内源性T细胞激活：吞噬后，CAR-DCs处理全细胞内容物，并通过MHC-I呈递广泛的肿瘤衍生肽库，以激活内源性CD8⁺ T细胞。（3）通过表位扩散消除抗原阴性克隆：这些被激活的内源性T细胞是多克隆的，可以识别多种肿瘤抗原，使它们能够根除通过丢失靶抗原（例如CLL1阴性细胞）而逃逸CAR-T疗法的AML细胞群。这种从单一抗原扩展到其他抗原的免疫过程称为表位扩散。

CAR-DCs靶向和消除CAR抗原阴性细胞的过程如下：CAR介导的吞噬 → 广泛的抗原处理和交叉呈递 → 激活针对多种肿瘤抗原的内源性T细胞 → 通过表位扩散消除抗原阴性克隆。

使用基因敲除模型验证靶点特异性

体外验证通常涉及使用CRISPR-Cas9或RNA干扰在AML细胞系中敲除靶抗原（例如CLL1）。例如，CLL1-KO AML细胞对CLL1靶向的CAR-T细胞杀伤的敏感性显著降低，同时保留对靶向其他抗原（例如CD33或CD123）的CAR-T细胞的敏感性，这也证实了CAR结构的抗原特异性。类似地，当CAR-DCs与CLL1-KO AML细胞共培养时，它们的吞噬能力和随后的T细胞激活显著减弱，强调了其对CAR介导识别的依赖性。

体内研究使用CLL1缺陷型AML细胞建立的异种移植模型进一步验证了这些发现。在此类模型中，与它们对CLL1阳性肿瘤的活性相比，CLL1 CAR-T细胞表现出对白血病控制力的降低，突出了抗原表达在治疗效果中的作用。此外，在双瘤模型（一个肿瘤表达CLL1，另一个是CLL1-KO）中，过继转移CLL1 CAR-T细胞联合CAR-DCs导致CLL1阳性肿瘤优先消退，而对KO肿瘤的影响有限，除非通过CAR-DC介导的交叉呈递发生表位扩散。这些KO模型不仅确认了靶向作用机制，而且有助于阐明逃逸机制。例如，CLL1-KO模型中的残留疾病通常来自抗原低表达或抗原阴性克隆，从而强化了需要解决异质性的联合策略，例如引入CAR-DCs以扩大抗原识别范围。

基因敲除模型为CAR-DCs和CAR-T疗法的特异性和机制提供了不可或缺的证据。它们验证了靶向CLL1对于启动抗肿瘤反应既是必要的也是充分的，同时也揭示了其局限性，为设计下一代组合免疫疗法提供了信息。

CAR-DC联合CAR-T细胞疗法

CAR-DC疗法已在AML模型中显示出抗肿瘤疗效，并且正在针对实体上皮恶性肿瘤进行临床评估（NCT05631899和NCT05631886）。NCT05631899是一项初步临床试验，评估靶向EphA2的CAR-DC疫苗负载KRAS突变肽（KRAS-EphA2-CAR-DC）联合免疫检查点抑制剂（ICIs）在局部晚期或转移性实体瘤患者中的安全性、免疫活性和疗效。临床前研究结果表明，工程化的CAR-DCs在实体瘤小鼠模型中可增强共同给药的CAR-T细胞的细胞毒性。NCT05631886是一项平行的初步试验，评估靶向EphA2的CAR-DC疫苗负载TP53突变肽（TP53-EphA2-CAR-DCs）联合ICIs在实体瘤或R/R淋巴瘤中的应用。

多项研究表明，瘤内递送DCs可以安全地增强CAR-T细胞活性并缓解免疫抑制性TME。体外分化表达4-1BB的DCs富集CD141⁺/CIEC9A⁺ DC亚群。CAR-DC和CAR-T细胞的相互作用协同可增强抗AML的细胞毒性。DC来源的细胞因子（如IL-12和I型干扰素）在抗原呈递过程中提供额外的T细胞刺激，而CAR-T细胞保留其独立于DCs的内在细胞毒性能力。这些数据表明，瘤内CAR-DC递送建立了一个“免疫生态位”，CAR-DCs分泌IL-12和I型干扰素以逆转T细胞耗竭并重塑TME。这种协同作用通过DC介导的抗原扩散和局部免疫激活，解决了CAR-T细胞的局限性，包括肿瘤浸润不足和抗原丢失。

研究进一步证明，4-1BB工程化的自体DCs通过分泌细胞因子和促进CAR-T细胞募集到骨髓生态位，增强了抗CD33 CAR-T细胞在AML中的疗效。CAR-DCs和CAR-T细胞之间的协作互动可能代表了改善抗肿瘤免疫疗法的一种有力策略。

CAR-DC和CAR-T细胞协作的机制概述（图1）：（1）CAR-DCs通过CAR靶向吞噬AML细胞，处理抗原并通过MHC-I/II交叉呈递肿瘤衍生肽以激活内源性T细胞。（2）CAR-DCs分泌细胞因子如IL-12以促进CAR-T细胞支持其活化、增殖和持久性，减少耗竭并支持记忆形成。（3）活化的内源性T细胞和CAR-T细胞通过直接细胞毒性和表位扩散协同根除CLL1阳性和CLL1阴性AML群体。CAR-DCs的比较特征总结在表1。

因此，CAR-DCs和CAR-T细胞疗法表现出很强的互补性，可以在增强CAR-T细胞功能的同时克服免疫逃逸以减少肿瘤复发。CAR-DC和CAR-T细胞联合策略的局限性可总结如下：（1）仅有早期临床证据——这种联合疗法的疗效主要得到临床前数据的支持，而人类临床证据仍然局限于早期试点研究（例如NCT05631899和NCT05631886），明确的治疗价值尚未确立。（2）物流和生产复杂性——这种治疗模式需要生产、质量控制和施用两种先进的细胞产品（CAR-DCs和CAR-T细胞），与单细胞产品相比，显著增加了复杂性、成本和可扩展制造的障碍。（3）在人类肿瘤中未经证实的协同作用——尽管动物模型支持创建能够逆转T细胞耗竭并克服免疫抑制性TME的“免疫生态位”，但在人类肿瘤中仍需一致确认。（4）安全性不确定性——工程化免疫细胞群体的双重激活可能放大毒性风险，包括加剧的CRS。这种联合方法的完整安全性特征仍未得到充分表征。表2。

CAR-DCS的设计与功能优化

CAR胞内信号区域的选择和设计在基于DC的疗法中至关重要，因为它能够在肿瘤抗原识别后实现DC分化、吞噬作用和抗原交叉呈递（图2）：

1.4-1BB信号域：在AML共培养实验中，含有4-1BB-CD35细胞内区域的CD33 CAR-DCs可以激活CAR-T细胞并增强其抗肿瘤活性。

2.FLT3L信号域：华盛顿大学开发了具有FLT3整合结构域的CAR-DCs，以支持cDC1分化并改善肿瘤抗原的交叉呈递。分泌FLT3L的工程化T细胞与模式识别受体poly(I:C)和4-1BB激动剂协同作用，增加瘤内DC积累和全身抗肿瘤反应，减轻实体瘤中抗原阴性肿瘤的逃逸。

3. CD40信号域：CD40信号激活增加MHC-II、共刺激分子（CD86/CD70/CD80）和细胞因子（IL-12、TNF-α），从而加强交叉呈递。临床前证据表明，含有CD40的CAR-DCs联合BCMA CAR-T细胞可改善抗骨髓瘤活性。

因此，选择合适的胞内结构域（例如4-1BB、FLT3或CD40）可以促进CAR-DCs在遇到肿瘤后成熟，并抵消TME的抑制。

新兴技术与未来方向

iPSC来源的异基因CAR产品

iPSC来源的同种异体CAR平台提供了一种现成的解决方案，以减少与自体疗法相关的成本、复杂性和变异性。FT819（抗CD19 CAR-T细胞，带有TRAC整合的CAR）在I期试验中未显示剂量限制性毒性、GVHD或严重CRS，15名患者中有4名出现反应，FT825/ONO-8250（抗HER2，七次编辑）旨在改善实体瘤靶向。iCAR-NK项目包括FT596（抗CD19 + hnCD16 + IL-15RF），在17名患者中有9名显示出反应，而FT522/FT576包括用于持久性和联合疗法的编辑。Century Therapeutics的CNTY-101是一种多编辑的靶向CD19的iCAR-NK疗法，在I期试验中未显示显著毒性，缓解率为40%。这些发现证明了标准化、可扩展和异基因免疫疗法的潜力。iPSC平台的核心优势在于生成无限的、均一的CAR-DCs和CAR-T细胞，以克服自体双细胞疗法固有的成本和制造障碍。

功能性成熟的iPSC来源的CAR-T（iCAR-T）细胞的开发遇到显著的技术限制。当前的分化方法主要产生先天样T细胞（iT细胞），表达CD8αα和CD56，但缺乏CD8αβ、CD2、CD5和CD28。一个主要问题在于未能有效通过双阳性（DP）阶段，这对于常规αβ T细胞发育至关重要。过早的TCR或CAR表达（常见于T细胞来源的iPSCs或组成型CAR构建体）会破坏DP形成，并通过抑制Notch信号（降低Notch1/3及下游效应子）和减少PTCRA表达（αβ T细胞成熟所必需）使分化偏向于先天CD8αα+或γδ T样表型。

改善T谱系定向的策略包括（a）去除双阴性T细胞以避免DP祖细胞耗竭；（b）使用OP9-DLL4或3D胸腺类器官增加Notch信号；（c）采用包含4-1BB而非CD28的CAR设计以增强DP转变和CD8αβ+发育；（d）靶向TRAC插入并减弱ITAMs以限制强直信号并保留Notch/PTCRA表达；（e）在分化过程中提供CAR抗原和4-1BBL以支持DP到SP的成熟。大多数系统主要产生CD8+ iCAR-T细胞，即使使用CD4+起始群体也是如此。与人工胸腺类器官共培养能够产生CD4+ iT细胞，并且最近一种使用PMA/离子霉素将DP细胞偏向CD4+谱系的无饲养层方法提供了一个可扩展的替代方案。平衡的CD4+/CD8+比率可能改善持久性和抗肿瘤功效。

这些发现突出了双重基因工程（例如，在iPSCs中整合CAR同时维持DC分化潜能）的困难，并强调了消除异基因反应性（例如通过人类白细胞抗原[HLA]编辑）的必要性，这进一步增加了开发的复杂性。

体内CAR细胞编程

直接的体内CAR基因递送可以内在地激活T细胞，例如，通过LNP中RNA触发的先天免疫感应。与体外制造过程中应用的强烈人工刺激不同，体内生成的CAR-T细胞在生理抗原驱动下逐渐扩增，保留干细胞样特征，避免耗竭并表现出持续的抗肿瘤活性。体内递送可能优先转导分化程度较低的T细胞，包括初始（Tn）、干细胞样记忆或中央记忆亚群，它们具有优越的增殖能力、持久性和抗肿瘤效力。即使重编程少量这些细胞也能产生持久的反应。局部给药（例如，瘤内）可以通过工程化组织驻留记忆T细胞进一步增强疗效，使其能够直接靶向肿瘤而不依赖于运输。动态TME激活：体内生成的CAR-T细胞在TME内经历渐进式激活。与完整的宿主免疫系统协同：因为体内CAR-T疗法通常不需要或仅需要有限的清淋化疗，宿主免疫力在很大程度上得以保留。

传统的体外CAR-T细胞产品需要复杂、长达数周的生产过程，并且受到患者T细胞健康度差异的限制。体内CAR-T疗法则是将CAR编码载体直接给予患者，其使用两种主要系统，病毒载体和非病毒载体。病毒载体（例如AAV和慢病毒）支持长期表达而不整合，但缺乏内在的T细胞趋向性，慢病毒可以通过假型化靶向配体（例如抗CD3/CD8 scFv）来改善T细胞特异性。成功的体内CAR-T生成已在临床前研究中消除了CD19⁺ B细胞恶性肿瘤。其挑战包括插入突变、脱靶转导（例如生殖系或恶性克隆）和预先存在的免疫力。

非病毒纳米颗粒平台

LNP或基于聚合物的纳米载体主要递送CAR编码的mRNA用于瞬时表达，或DNA用于潜在的稳定整合（例如piggyBac转座子）。未靶向的LNP主要积聚在肝脏和脾脏，而与T细胞特异性抗体（例如抗CD5）结合的靶向LNP提高了递送准确性。编码针对前列腺或肝脏肿瘤抗原的CAR mRNA的聚合物纳米颗粒抑制了小鼠的肿瘤生长。AAV介导的体内CAR-T生产在鼠类模型中诱导了肿瘤消退。靶向CD33和CD123的Loop33和123 CAR-T细胞消除了AML细胞并延长了白血病小鼠的生存期，同时减轻了免疫逃逸。其关键挑战在于瞬时表达，需要重复给药，以及与抗体结合相关的制造复杂性增加和潜在免疫原性。

关键局限性包括：（1）递送效率和特异性——实现靶向基因转导仅进入所需的T细胞亚群仍然困难；（2）安全控制——与体外产品不同，体内生成的CAR-T细胞在输注前无法进行批次水平的表型分析或安全开关激活；（3）瞬时表达风险——非病毒系统可能产生短命的CAR表达，需要重复给药。

逻辑门控和合成基因路径

布尔逻辑门（例如，“OR”、“AND”和“NOT”）是最近用于增强CAR-T精确性和安全性的创新。

最简单的AND门策略靶向在癌细胞上共表达但不在正常细胞上表达的两个肿瘤相关抗原（TAAs），使得仅当两个抗原都被结合时才启动细胞毒性。对于TCEs，选择性消除双TAA⁺细胞源于协同结合（伪亲和力）。一种针对B7-H4和LY6E的三特异性TCE在结直肠癌中表现出优先活性。ISB2001（抗BCMA/CD38）作为一个严格的AND门，在单个抗原删除后显示出100倍的活性降低。拆分半抗体TCEs将抗CD3 VH/VL结构域定位在单独的蛋白质上，这些蛋白质仅在双TAA⁺细胞上重新组装。精确GATE平台结合了延长半衰期的半抗体和蛋白酶掩蔽以改善性能。拆分CAR系统将激活和共刺激信号分离。一个低亲和力的CD138（刺激性）CAR与一个高亲和力的CD38（共刺激性）CAR配对，区分了骨髓瘤组织和健康组织。Tousley等人开发了一种抗泄露的AND门CAR，包含LAT和SLP76结构域，需要双抗原输入。SynNotch CARs，例如抗EGFRvIII传感器驱动EphA2/IL13Rα2-CAR表达，减少了胶质母细胞瘤中的抗原逃逸，并正在进行临床评估（NCT06186401）。

OR门设计将两个或多个结合物整合到单个CAR中或在单个载体中表达多个单特异性CAR。双顺反子CARs允许每个构建体具有不同的共刺激结构域，以扩大信号多样性。仔细的抗原选择确保结合一个靶标不会损害对另一个靶标的识别，特别是在串联设计中。双/三抗原靶向已广泛应用于B细胞淋巴瘤，其中抗原丢失导致复发。由于B细胞发育不全在临床上是可控的，同时靶向CD19、CD20和CD22较常见。Tian等人开发了一种针对神经母细胞瘤的双顺反子CAR，靶向GPC2和B7-H3，解决了肿瘤内异质性。CITE-Seq确定了用于T细胞扩增和表型的最佳CARs。与单靶点CAR-T细胞相比，双顺反子产品在体外和体内消除了单阳性和双阳性肿瘤细胞，并在混合异种移植瘤中表现出增强的持久性和减少的耗竭。另一种策略是工程化CAR-T细胞以分泌识别第二个抗原的双特异性TCEs，创建局部化的OR门。

NOT门逻辑依赖于保护性抗原的差异表达，该抗原存在于正常细胞上但在肿瘤细胞上缺失，类似于NK细胞通过KIR受体进行的抑制。抑制性CARs（iCARs）包含ITIM基序，在结合保护性抗原时抑制T细胞活化。早期的iCARs包含PD-1或CTLA-4细胞内结构域，能够实现快速、可逆的抑制，优于不可逆的杀伤开关。增强iCAR亲和力并整合双重抑制结构域（例如，PD-1结合LAIR-1或SIGLEC-9）显著提高了布尔精度并减少了逃逸信号延迟。关键设计考虑因素包括iCAR亲和力及其相对于激活CAR的表达水平，单独增加亲和力可能不会增强抑制，而增加亲和力（例如通过更高的受体密度或靶标丰度）可以显著改善抑制。得注意的是，iCARs通常比即时细胞毒性更有效地抑制增殖和细胞因子释放，后者依赖于预先形成的颗粒。

一个有临床前景的策略是利用肿瘤HLA杂合性缺失。Timod系统将一个识别HLA-A*02（通常在肿瘤中丢失）的抑制性CAR与一个靶向抗原（如间皮素或癌胚抗原）的激活性CAR配对。丢失β2-微球蛋白（β2M）的肿瘤细胞逃避免抑制信号，仍然易受杀伤，而正常的HLA-A02⁺/β2M⁺细胞受到保护。作者课题组开发了CD16-CLL1 iCAR-T细胞，该细胞保留对白血病的活性，同时避免中性粒细胞，显著降低了CAR-T细胞治疗期间粒细胞减少的发生率。

其局限性包括：（1）工程复杂性和脱靶风险——复杂的多抗原逻辑设计（例如，串联CARs、拆分电路）可能导致scFv干扰或“泄露”信号，增加靶向、脱肿瘤毒性。（2）严格的抗原谱要求——AND门要求两个肿瘤限制性抗原共表达，而NOT门依赖于恶性肿瘤上保护性标记物的持续缺失。肿瘤异质性和抗原丢失仍然是主要的逃逸途径。（3）动力学和效力限制——抑制信号可能太慢而无法防止对正常细胞的早期细胞毒性损伤，并且复杂的信号模块可能降低整体T细胞活力。（4）临床验证有限——大多数逻辑门控系统仍处于临床前或早期临床阶段。它们在人类TME中的性能尚未明确确定，抑制性肿瘤生态位可能损害通路保真度。

装甲CAR-T设计

装甲CAR-T设计旨在通过实现自分泌细胞因子支持来增强抗肿瘤功能。IL-2：IL-2分泌在临床前黑色素瘤模型中促进T细胞增殖和肿瘤消退，但临床试验显示毒性而未改善疗效。IL-12：IL-12效力强但全身毒性大。来自CAR-T细胞的肿瘤局部IL-12在鼠类模型中增加了抗肿瘤免疫力并重编程了髓系区室。可诱导系统（例如，NFAT调节的IL-12）提高了安全性，并且CD19-CAR/IL-12 T细胞在同基因环境中实现了肿瘤清除和对Treg介导的抑制的抵抗。IL-15：IL-15增强T细胞和NK细胞的持久性；在临床前研究中，组成型表达改善了CAR-T的持久性，但已有报道称不受控制的增殖和致白血病事件。整合可诱导的自杀开关（例如，iCaspase9）提高了安全性。IL-21：体外IL-21改善了CAR-T细胞对抗Nalm6的扩增和细胞毒性，但IL-21转基因的可行性需要进一步评估。

装甲CARs的局限性包括：（1）细胞因子相关毒性——即使是受限的IL-12或IL-15分泌也有CRS和ICANS风险。（2）控制的挑战——严格的时间调控困难；组成型细胞因子产生可驱动不受控制的增殖和恶性转化。（3）治疗窗狭窄——临床经验，尤其是IL-2，显示毒性往往比获益上升得更快。（4）长期临床证据有限——可诱导细胞因子工程系统的安全性和耐久性在大型试验中仍未得到充分测试。

异基因UCAR-T细胞

用于UCAR-T细胞制造的多种细胞类型显示出对移植物抗宿主病（GvHD）的天然抵抗力，包括γδ T细胞、恒定自然杀伤T细胞（iNKTs）、双阴性T细胞（DNTs）和病毒特异性T细胞（VSTs），以及工程化平台，如iPSCs和胎盘循环T（P-T）细胞。它们独特的抗原识别机制在实体瘤中提供了潜在优势。

γδ T细胞：γδ T细胞（占外周CD3⁺细胞的5%，以Vy9V62为主）识别不依赖于HLA的配体，最小化GvHD风险。即使CAR靶向抗原丢失，其先天细胞毒性仍然存在，解决了异质性问题。ADI-001（靶向CD20的γδ UCAR-T）在B细胞恶性肿瘤中达到67%的总缓解率，并且尽管HLA不匹配，仍表现出剂量依赖性扩增。 γδ T细胞还利用NKG2D介导的靶向，例如，替莫唑胺在胶质母细胞瘤中上调NKG2DL，增强了γδ T细胞的肿瘤识别。

iNKT细胞：iNKT细胞通过CD1d识别糖脂，这是一种HLA非依赖性机制，降低了GvHD风险。它们优先通过趋化因子如CCL2和CCL20归巢到肿瘤，使它们在实体瘤靶向中具有优势。 CAR-iNKTs已在血液系统和实体恶性肿瘤中进行研究。一种先进的异基因CD19-CAR iNKT产品共表达IL-15和针对B2M/CD74的shRNA（以减少HLA-I/II表达），在R/R非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病中显示出疗效。表达IL-15的自体GD2-CAR iNKTs在神经母细胞瘤中诱导了完全缓解。除了直接肿瘤杀伤，CAR-iNKTs还可通过交叉启动CD8⁺ T细胞、消耗免疫抑制性CD1d⁺ TAMs和MDSCs、激活DCs和促进表位扩散，对宿主免疫力做出贡献。

DNTs：DNTs（CD3+CD4−CD8−）很少引起GvHD。从AML患者扩增的异基因DNTs通过NKG2D和DNAM-1途径显示出安全性和抗肿瘤活性。CD19-CAR-DNTs有效靶向B细胞白血病和肺癌，且不诱导GvHD。靶向T细胞恶性肿瘤的CAR4-DNTs在联合idelalisib时表现出改善的持久性。一项针对B细胞淋巴瘤的异基因CD19-CAR-DNTs（RJMty19）的I期试验报告无≥3级CRS、ICANS、GvHD或DLTs，并且所有高剂量患者均缓解。

VSTs和工程化细胞来源：VSTs具有受限的TCR库，可降低GvHD风险，在临床上用于治疗HSCT后的病毒感染，但抗癌应用仍然有限。iPSCs提供了可再生的CAR-T来源，通过3D类器官分化的CAR-iPSCs产生具有均一TCRs和降低MHC表达的功能性T细胞，最小化GvHD和排斥。抑制G9a/GLP可增强iPSC-T细胞成熟和CAR效应功能。

异基因UCAR-T细胞来源的局限性：（1）细胞来源稀缺和扩增困难——γδT细胞、iNKTs和DNTs在外周血中稀少，增加了分离、工程化和大规模扩增的复杂性和成本。（2）持久性和效力不确定——某些亚群，如VSTs，可能在体内持久性和扩增方面有限，降低了长期活性。（3）异基因排斥——宿主免疫可能由于HLA不匹配而消除异基因CAR-T细胞，限制其持久性。尽管iPSCs中的HLA编辑可以缓解这一点，但残留风险仍然存在。（4）技术复杂性——iPSC来源的CAR-T制造需要重编程、基因编辑和受控分化，对可扩展和一致的生产构成挑战。（5）非常规安全性特征——γδT细胞或iNKT的天然反应性可能在正常组织中引起靶向、脱肿瘤效应，需要仔细评估。

与CAR-DCS相关的挑战和局限性

DCs的可塑性与AML中的内在功能障碍

AML破坏了正常的DC发育，其特征是在诊断时FLT3-ITD+患者中积累停滞的DC前体（Lin−HLA-DR+CD1c+CD123+）和缺乏终末DC亚群（BDCA-1+/BDCA-3+ mDCs；BDCA-2+ pDCs）。即使在缓解期，髓系DC功能受损仍然存在，表明可能存在内在的成熟缺陷，可能限制CAR-DC的疗效。柔红霉素等化疗药物可以通过诱导濒死母细胞释放ATP，激活DCs中的P2X7-IDO1轴并促进Treg扩增，从而加剧免疫抑制。因此，AML受训的DCs和CAR-DCs可能保留异常的可塑性或耐受性特征。

肿瘤诱导的耐受性DC表型：（1）代谢物驱动的耐受性——mregDCs迁移到肿瘤dLNs，在那里它们抑制交叉呈递并诱导Th2和Treg分化。肿瘤来源的乳酸激活DCs中的固醇调节元件结合蛋白2（SREBP2），促进甲羟戊酸依赖的mregDC分化，从而抑制CD8+ T细胞并增强Th2/Treg反应。（2）基质信号——CAF分泌的WNT2通过SOCS3/p-JAK2/p-STAT3信号抑制DC成熟，削弱抗肿瘤免疫。这些通路表明，输注的CAR-DCs可能被TME“再受训（re-educated）”成IDO1+CD39+DCs或mregDCs，从而降低与CAR-T细胞的协同作用。（3）物流和生物学复杂性——双细胞制造与单细胞疗法相比显著增加了成本和复杂性。预测性生物标志物仍不明确，仅TP53/KRAS突变可能无法识别最佳候选者。

临床前证据表明CAR-DCs具有几个理论优势：（1）抗原获取保真度——cDC疫苗依赖于肿瘤裂解物或选定的肽段，而CAR-DCs在体内主动定位肿瘤细胞，并直接从患者的TME获取多样化的抗原库，这是在异质性疾病如AML中的一个关键特征。（2）克服DC功能障碍——鉴于AML中的内源性DCs常常受损，具有激活结构域（例如CD40或4-1BB）的工程化CAR-DCs可以在CAR信号传导时实现快速成熟，并比cDC疫苗更有效地抵抗TME抑制。（3）协同免疫协调——除了作为改进的抗原呈递平台外，CAR-DCs还充当原位免疫组织者，通过细胞因子分泌（例如IL-12）和诱导表位扩散来支持共同给药的CAR-T细胞。CAR-DCs联合CLL1 CAR-T细胞代表了一种克服R/R AML当前疗效障碍的新方法。对CAR-DC生物学的更深入机制理解将支持临床转化，并为在难治性或复发性AML中整合CAR-DCs与CLL1 CAR-T疗法提供科学基础。

CAR-DCs也面临多个挑战：（1）功能复杂性——间接“旁观者”杀伤抗原阴性肿瘤的疗效完全依赖于高效的交叉呈递和表位扩散，这在免疫抑制环境中可能不理想。（2）安全性考虑——尽管CAR-DCs和CAR-T细胞之间的协同作用提供了一种增强抗肿瘤免疫的引人注目的策略，但两种模式都经过工程化以实现强大的免疫激活，从而引发了关于放大的免疫相关毒性的担忧，特别是CRS。CAR-DC和CAR-T共同给药的临床前研究已证明细胞因子释放增加（例如IL-6、IL-12、IFN-γ），可能增加CRS风险。现有的初步临床数据（例如NCT05631899）尚未报告严重CRS，但样本量仍然很小。CAR-DCs可能通过局部细胞因子释放和表位扩散支持更可控的激活，可能比独立的CAR-T疗法降低全身毒性。尽管如此，未来的临床方案仍应包括严格的监测、预防措施（例如托珠单抗、皮质类固醇）和可诱导的安全开关，如基于caspase的自杀系统，以便在免疫激活过度时能够快速干预。（3）TME抵抗——虽然CAR-DCs可以被工程化以分泌如IL-12等细胞因子，但这种功能的长期维持以及它们抵抗抑制性TME的耐受性重编程的能力仍有待证明。（4）CAR设计和患者选择——应优先优化细胞内信号模块（例如FLT3和CD40），未来的研究必须建立合理的患者选择标准，并纳入预测性生物标志物，包括TME分析。

CAR-DCs与靶向CLL1的CAR-T细胞的结合构成了一种变革性的治疗策略，可同时解决R/R AML患者的抗原逃逸和免疫抑制问题。CAR-DCs作为第一波“免疫协调者”，通过重塑TME，从而促进CAR-T细胞更有效的第二波攻击。通过协同增强抗原呈递和逆转T细胞耗竭，这种双细胞方法有潜力诱导更深层次和更持久的缓解。为了将这一有前景的临床前策略转化为临床实践，有几个关键领域需要进一步研究。首先，在CAR-DCs的工程化中，必须确定最佳的共刺激信号结构域——例如用于DC成熟的CD40与用于扩增的FLT3L——以及双靶向CARs的可行性。其次，临床开发必须确定这种联合疗法的安全性特征，特别是关于CRS，并优化给药方案和给药途径。预测性生物标志物的识别对于适当的患者选择至关重要。此外，通过三重组合方法，例如纳入ICIs以防止内源性和CAR-T细胞的功能耗竭，可能会增强治疗效果。虽然从一个引人注目的临床前概念到确立的临床疗法的道路仍然复杂，但这两种细胞免疫疗法之间合理设计的协同作用代表了改善R/R AML预后的一个有希望的进展。

参考文献

Zhang R, Zhang J, Zhang H, Zhao M. CAR-DC combined with CAR-T therapy for relapsed/refractory acute myeloid leukaemia: Research progress and future perspectives. Clin Transl Med. 2025 Dec;15(12):e70536. doi: 10.1002/ctm2.70536. PMID: 41292193.