北京大学口腔医院ACS Nano：新型纳米平台通过“衰老启动铁死亡”策略增强癌症治疗

在多种人类癌症中，细胞周期蛋白D-CDK4/6-视网膜母细胞瘤（Rb）通路的异常激活是驱动细胞不受控增殖和肿瘤进展的常见事件。选择性CDK4/6抑制剂（如帕博西尼）通过阻滞细胞周期和诱导肿瘤细胞衰老，展现出治疗潜力，且对正常组织毒性较小。然而，其主要作用是抑制细胞生长而非直接杀死细胞，这导致肿瘤清除不完全和产生治疗抵抗。此外，衰老细胞会分泌衰老相关分泌表型（SASP）因子，反而可能促进肿瘤进展和免疫逃逸。这些局限性阻碍了CDK4/6靶向疗法在更广癌症类型中的应用，其中，CDK4/6通路高度活化的HPV阴性口腔鳞状细胞癌（OSCC）因侵袭性强、标准治疗反应有限和预后差，成为开发新策略的理想模型。

为了克服这些挑战，北京大学口腔医院王宇光主任医师、Zhang Ludan和Li Yike合作提出了一种“衰老启动的铁死亡”策略，并构建了一种基于金属有机框架（MOF）的纳米平台（ZPG），用于共同递送CDK4/6抑制剂帕博西尼和铁死亡诱导剂镓离子（Ga³⁺）。该平台具有良好的生理稳定性、改善的细胞摄取和控制性药物释放能力。在CDK4/6高活性的OSCC细胞中，帕博西尼能选择性阻滞细胞周期并诱导强烈的衰老，导致抗铁死亡因子（GPX4和GSH）下调和促铁死亡因子（ACSL4和Fe²⁺积累）上调。这种重编程削弱了细胞的抗氧化防御，促进了脂质过氧化，从而使衰老细胞对铁死亡敏感。同时，Ga³⁺在蛋白质结合中模拟Fe³⁺并扰乱铁代谢，进一步放大了铁死亡应激，选择性促使衰老肿瘤细胞发生铁死亡。这种协同机制在体外和体内均显著增强了抗肿瘤疗效，且脱靶毒性极低。相关论文以“Senescence-Primed Ferroptosis Enabled by a Metal–Organic Framework Nanoplatform for Enhanced Cancer Therapy”为题，发表在ACS Nano上。

研究人员首先成功设计并合成了ZPG纳米颗粒。表征结果显示，ZPG纳米颗粒呈现出均匀的花状结构，粒径分布适中，并成功负载了帕博西尼和Ga³⁺。X射线光电子能谱和X射线衍射等分析证实了Ga³⁺的掺入以及药物成功装载到MOF骨架中。稳定性实验表明，ZPG在生理pH下稳定，而在酸性溶酶体环境中能实现pH响应性的药物快速释放，这有利于药物在肿瘤细胞内高效释放。

示意图1. 用于通过衰老启动铁死亡实现选择性增强癌症治疗的ZPG“纳米净化器” (a) 设计和合成用于癌症治疗的ZPG纳米颗粒示意图。(b) ZPG通过阻断CDK4/6介导的细胞周期进程诱导衰老，从而使肿瘤细胞对Ga³⁺诱导的铁死亡敏感。这种衰老启动的铁死亡策略能够选择性消除具有CDK4/6高活性的肿瘤细胞，同时最大限度地减少对正常细胞的脱靶毒性。 

图1. ZPG纳米颗粒的合成与表征 (a) ZIF、ZP、ZG和ZPG纳米颗粒的合成示意图。(b) ZIF、ZP、ZG和ZPG纳米颗粒的透射电镜图像。(c) ZIF、ZP、ZG和ZPG纳米颗粒的粒径分布。(d) ZIF、ZP、ZG和ZPG纳米颗粒的能谱元素分布图（Co, Ga）及合并图像。(e) ZPG纳米颗粒的高角度环形暗场扫描透射电镜图像及相应元素分布图。(f) ZIF、ZG和ZPG的X射线光电子能谱全谱图。(g) ZIF、ZP、ZG和ZPG的X射线衍射图谱。(h) ZIF、ZP、ZG、ZPG和游离帕博西尼的傅里叶变换红外光谱图。(i) ZPG纳米颗粒在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中孵育不同时间后的透射电镜图像。(j) ZPG纳米颗粒在pH 7.4条件下孵育不同时间后的粒径和zeta电位变化。(k) ZPG纳米颗粒在不同pH缓冲液中帕博西尼的累积释放曲线。(l) ZPG纳米颗粒在不同pH缓冲液中Ga³⁺的累积释放曲线。

在体外抗肿瘤活性评估中，ZPG在OSCC细胞（MOC-1）中显示出优异的细胞摄取和最强的细胞毒性，且对正常成纤维细胞（L929）的毒性显著更低，体现了其肿瘤选择性。这种选择性杀伤作用源于ZPG能高效诱导CDK4/6高活性OSCC细胞衰老。实验证实，ZPG处理导致MOC-1细胞G0/G1期阻滞比例大幅增加，衰老标志物SA-β-半乳糖苷酶活性和p16INK4a蛋白表达显著上升，同时SASP因子分泌增多。而在正常L929细胞中，这些衰老指标变化甚微。

图2. ZPG在OSCC细胞中的选择性及强效抗肿瘤活性 (a) ZPG介导的帕博西尼和Ga³⁺协同增强癌细胞细胞毒性示意图。(b) MOC-1细胞与FITC标记的ZPG孵育不同时间后的共聚焦荧光图像。(c) 通过ICP-MS测定的MOC-1细胞对ZPG或游离Ga³⁺的摄取量。(d) 用不同浓度的ZIF、ZP、ZG和ZPG处理MOC-1细胞12小时后的细胞活力（CCK-8法）。(e) 用不同浓度的ZIF、ZP、ZG和ZPG处理L929细胞12小时后的细胞活力。(f) 在200 μg/mL纳米颗粒浓度下，MOC-1和L929细胞的细胞活力对比。(g, h) 用不同纳米颗粒（200 μg/mL）处理12小时后，MOC-1细胞 (g) 和L929细胞 (h) 的活细胞（绿色，Calcein-AM染色）/死细胞（红色，碘化丙啶染色）荧光图像。

图3. ZIF基制剂诱导衰老的体外评价 (a) ZPG选择性诱导CDK4/6高活性肿瘤细胞衰老示意图。(b) 不同制剂处理后MOC-1细胞周期的流式细胞术分析。(c) 不同制剂处理后MOC-1和L929细胞的代表性SA-β-半乳糖苷酶染色图像及阳性细胞定量分析。(d) 不同制剂处理后MOC-1和L929细胞的代表性p16INK4a免疫荧光图像及阳性细胞定量分析。(e-h) MOC-1和L929细胞中SASP因子（包括IL-1α (e)、IL-6 (f)、IL-8 (g) 和CXCL-10 (h)）的定量分析。(i) 总结MOC-1和L929细胞中衰老相关标志物水平的雷达图。

进一步研究表明，ZPG诱导的衰老增强了OSCC细胞对铁死亡的敏感性。与仅负载单一组分的纳米颗粒相比，ZPG引起了最显著的铁死亡表型：细胞内Fe²⁺和活性氧积累大幅增加，线粒体膜电位下降，谷胱甘肽耗竭，脂质过氧化水平升高，乳酸脱氢酶释放增多。同时，Western blot分析显示，ZPG能协同下调关键抗铁死亡蛋白GPX4并上调促铁死亡蛋白ACSL4的表达，从分子水平上促进了铁死亡进程。RNA测序分析进一步从全局基因表达层面证实，ZPG处理激活了细胞衰老和铁死亡相关通路。

图4. ZIF基制剂诱导铁死亡的体外评价 (a) 不同纳米颗粒处理后MOC-1和L929细胞内的Fe²⁺积累。(b) 不同制剂处理后MOC-1和L929细胞内活性氧生成的流式细胞术分析。(c) 不同制剂处理后MOC-1细胞线粒体膜电位的流式细胞术分析。(d) 不同纳米颗粒处理后MOC-1和L929细胞的细胞内GSH水平分析。(e) 不同纳米颗粒处理后MOC-1和L929细胞的LPO水平分析。(f) 不同纳米颗粒处理后MOC-1和L929细胞的LDH释放。(g, h) 不同制剂处理后MOC-1和L929细胞中GPX4和ACSL4表达的Western blot分析 (g) 及密度定量分析 (h)。

图5. ZPG在MOC-1细胞中抗肿瘤作用的RNA测序分析及机制图 (a) ZIF处理和ZPG处理的MOC-1细胞之间差异表达基因的火山图。(b) 差异表达基因的基因本体富集分析。(c) 京都基因与基因组百科全书通路富集分析。与铁死亡、细胞衰老和矿物质吸收相关的通路被高亮显示。(d) 衰老相关基因的热图。(e) 铁死亡相关基因的热图。(f) ZPG诱导衰老启动铁死亡并协同增强抗肿瘤功效的分子机制示意图。

在MOC-1细胞构建的皮下移植瘤小鼠模型中，体内实验验证了ZPG的强大疗效。荧光成像显示ZPG能有效富集于肿瘤部位。治疗结果显示，ZPG组肿瘤生长受到最显著的抑制，肿瘤重量最小，且小鼠体重稳定，表明系统性毒性低。肿瘤组织病理学分析显示，ZPG治疗组出现大片坏死区域，同时衰老标志物p16INK4a表达上调，增殖标志物Ki67和抗铁死亡蛋白GPX4表达被强烈抑制，证明了衰老启动的铁死亡机制在体内的有效性。

图6. ZPG纳米颗粒的体内抗肿瘤功效 (a) 肿瘤建立、治疗和样本收集的实验时间线示意图。(b) 静脉注射Cy5.5标记的ZPG后不同时间点荷瘤小鼠的荧光图像。(c) Cy5.5标记的ZPG在MOC-1荷瘤小鼠肿瘤中的积累情况。(d) 对照组、ZIF组、ZP组、ZG组和ZPG组的肿瘤生长曲线。(e) 各组肿瘤体积的倍数变化（第14天肿瘤体积与第0天的比值）。(f) 各组剥离的肿瘤照片。(g) 各组的最终肿瘤重量。(h) 治疗期间小鼠的体重变化。(i) 各组肿瘤组织的H&E染色以及p16INK4a、GPX4和Ki67的免疫荧光染色。(j-l) 肿瘤组织中p16INK4a (j)、GPX4 (k) 和Ki67 (l) 表达的定量分析。

总之，本研究开发了一种基于ZIF-67 MOF的“纳米净化器”ZPG，通过协同递送帕博西尼和Ga³⁺，成功实现了“衰老启动的铁死亡”治疗策略。该策略能选择性诱导CDK4/6高活性肿瘤细胞衰老，进而敏化并促使它们发生铁死亡，在增强抗肿瘤疗效的同时最大限度保护正常细胞。这一策略不仅为口腔鳞癌，也为其他CDK4/6驱动的恶性肿瘤（如乳腺癌、脂肪肉瘤）提供了新的治疗思路。尽管大规模纳米药物生产、长期生物安全性评价和患者分层等临床转化挑战依然存在，但本研究确立的衰老启动铁死亡策略，为改善CDK4/6信号过度活化肿瘤的治疗带来了充满希望的新方向。