“渐冻症”有救了？突破性siRNA疗法，登上Nature Medicine！

深度解析医学证据，DeepEvidence为你支撑决策

突破性siRNA疗法RAG-17：为SOD1型肌萎缩侧索硬化症带来新希望

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种致命的神经退行性疾病，其治疗选择极为有限，部分原因在于其发病机制尚不完全清楚。超氧化物歧化酶1（SOD1）基因突变是导致家族性ALS的关键遗传因素之一，约占15-30%的家族性病例和高达2%的散发型病例，在亚洲人群中更为普遍。这些突变会产生具有毒性的错误折叠SOD1蛋白，通过“功能获得”机制驱动运动神经元变性。因此，降低突变型SOD1的表达成为针对该亚型患者极具吸引力的治疗策略。这一逻辑促成了反义寡核苷酸（ASO）药物Tofersen的加速批准，但探索具有更优安全性和给药方案的替代疗法仍是未满足的临床需求。在此背景下，一种名为RAG-17的新型siRNA-寡核苷酸偶联物应运而生，它利用创新的“智能化学辅助递送”平台，旨在攻克RNAi疗法向中枢神经系统递送的关键难题。

首都医科大学附属北京天坛医院王伊龙教授和中美瑞康李龙承博士合作，报道了新型SOD1靶向小干扰RNA药物RAG-17在SOD1型ALS患者中表现出良好的安全性和耐受性，并显著降低了疾病生物标志物水平。在这项开放标签、单中心、剂量递增的1期试验中，6名SOD1-ALS患者接受了多剂次鞘内注射RAG-17。治疗相关不良事件均为轻至中度，未发生严重不良事件。关键次要终点显示，队列1（共7剂）在第240天脑脊液SOD1蛋白水平较基线降低69%，队列2（共6剂）在第210天降低56%；血浆神经丝轻链蛋白水平在队列1和队列2中分别降低62%和52%，且研究期间无患者需要有创机械通气或死亡。这些结果支持RAG-17在SOD1-ALS中的持续临床开发。相关论文以“Oligonucleotide–siRNA conjugate for SOD1 amyotrophic lateral sclerosis: a phase 1 trial”为题，发表Nature Medicine上。

RAG-17是一种治疗性siRNA双链体，通过连接子与一个非靶向的、经过化学修饰的辅助寡核苷酸偶联。临床前研究表明，RAG-17在体外具有足够的血清稳定性——在与人血清共孵育后，RAG-17从第1天起逐渐释放其双链体siRNA，而辅助寡核苷酸组分基本保持结合状态。通过计算机预测和细胞实验验证，RAG-17在其引导链“种子区”完全互补且延伸区不超过4个错配的候选基因（包括CYTH2、NDUFC2、DISP2、KNOP1和UBAP2L）上，在0.25nM至25nM浓度范围内均未产生显著影响。此外，在利用人外周血单核细胞进行的免疫刺激活性评估中，无论是通过游离摄入还是转染方式，RAG-17本身及其双链体和辅助寡核苷酸组分均未诱导干扰素-α、肿瘤坏死因子或白介素-1β的表达。

临床前研究进一步揭示了RAG-17在中枢神经系统的广泛分布和持久作用。在大鼠中，鞘内注射后，RNAscope原位杂交显示RAG-17在腰脊髓注射部位附近浓度最高，在大脑的嗅球、海马和小脑等区域也达到较高水平。液相色谱-串联质谱分析证实，中枢神经系统中RAG-17水平以脊髓为最高，尤以腰段为著；脑干、小脑、海马和大脑水平相近，纹状体最低。中枢神经系统浓度在最初7天内迅速下降，此后趋于稳定，而肝脏和肾脏浓度在整个期间持续快速下降。雌性大鼠中枢神经系统清除略快于雄性，但肾脏清除较慢。外周组织中，肝脏、肾脏和脾脏的暴露水平与中枢神经系统组织相当，以肾脏为最高；但肾脏和肝脏清除较快（半衰期6-9天），而中枢神经系统组织半衰期达20-27天。

在极具挑战性的SOD1G93A ALS小鼠模型中，即使在疾病症状出现后的晚期（出生后第126天和第151天）开始治疗，RAG-17依然展现出显著疗效。与对照组（中位生存期169.5天）相比，晚期给予200μg和400μg RAG-17分别将中位生存期延长了78.5天（46.3%增加）和128.5天（75.8%增加），并显著改善了运动功能、肌肉力量和体重。而早期治疗（出生后第70天和第100天，400μg）则将中位生存期延长至331天（95%增加）（图1）。在SOD1G93A大鼠模型中，于出生后第70天和第130天进行两次鞘内注射0.9mg RAG-17，显著延缓了疾病发作（非靶向对照组中位发病期为187.5天，而RAG-17组在研究终点290天时仍未达到中位发病期），延长了生存期，并改善了运动功能和肌肉力量。腰脊髓胆碱乙酰转移酶染色显示，RAG-17显著保护了运动神经元，较非靶向对照组增加42.2%（P=0.0409），但未恢复至野生型水平。

图1 | RAG-17在SOD1小鼠中早期或晚期给药的疗效。 a，雌性SOD1小鼠早期或晚期治疗研究设计示意图。脑室内注射给药方案如下：对照组在出生后第126天和151天给予人工脑脊液（n=10）；早期RAG-17组在出生后第70天和100天给予400μg RAG-17（n=11）；晚期低剂量RAG-17组在出生后第126天和151天给予200μg RAG-17（n=10）；晚期高剂量RAG-17组在出生后第126天和151天给予400μg RAG-17（n=10）。b-d，通过转棒实验评估的运动功能（b）、前肢肌肉握力（c）和体重变化百分比（d）。数据以平均值±标准误表示。初始样本量为：对照组n=10，早期治疗400μg组n=11，晚期治疗200μg组n=10，晚期治疗400μg组n=10。 

在非人灵长类动物中的药效学研究为剂量选择提供了关键依据。尽管RAG-17的反义链相对于食蟹猴SOD1 mRNA在第13位存在单核苷酸错配，但其在COS-1细胞中敲低SOD1的效率与在人T98G细胞中相当。鞘内给药后，RAG-17在脑脊液和血浆中均呈剂量依赖性暴露，脑脊液水平远高于血浆（2至48小时间脑脊液/血浆比值范围为200至900）。药效学分析显示，RAG-17剂量依赖性地降低中枢神经系统组织和脑脊液中的SOD1 mRNA及蛋白水平（图2）。50mg剂量可使腰脊髓中SOD1 mRNA降低91%，且效果持续长达72天。整合药代动力学/药效学分析估算，腰骶脊髓中实现50%抑制的有效剂量在第22天和第71天分别为3.889mg和5.031mg，而大脑皮层则分别为51.37mg和108.4mg。基于三参数逻辑斯谛S型模型，腰脊髓和大脑皮层中实现半数最大抑制的浓度分别为165.2 ng/g和376.1 ng/g。

图2 | RAG-17在食蟹猴中的转化药效学研究。 a，研究设计示意图，显示两次鞘内给药和计划的尸检时间点（第22天，n=6；第71天，n=4）。b-e，通过RT-qPCR定量SOD1 mRNA水平，表示为相对于人工脑脊液对照组剩余SOD1 mRNA的百分比。检测部位包括颈髓（b）、胸髓（c）、腰髓（d）和大脑皮层（e）。数据以平均值±标准误表示（第22天，每组n=6；第71天，每组n=4）。f,g，通过ELISA评估脑脊液SOD1蛋白水平。f，数据以平均值±标准差表示，并叠加了每组在基线（给药前，n=6）、第22天（n=6）和第71天（n=4）的个体数据点。g，每只猴在所有时间点的脑脊液SOD1蛋白水平个体轨迹。h,k，在第22天和第71天，RAG-17剂量依赖性地降低腰骶脊髓（h）和额叶皮层（k）中的SOD1 mRNA。数据以平均值±标准误表示（第22天，每组n=6；第71天，每组n=4）。i,l，结合第22天和第71天的数据，比较不同剂量下RAG-17的组织暴露量（右y轴）和SOD1 mRNA沉默效果（左y轴）在脊髓（i）和大脑（l）中的情况。数据以平均值±标准误表示。j,m，暴露-反应相关图，显示脊髓（j）和大脑（m）中SOD1 mRNA水平与组织浓度的关系。浓度低于定量下限的样本被排除，最终得到j图中n=23个数据点和m图中n=11个数据点。P值通过单因素方差分析 followed by Dunnett's多重比较检验确定。*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; ****P<0.0001。Conc，浓度；grp，组别。 

基于上述临床前结果，研究者启动了这项首次人体临床试验。6名SOD1-ALS患者被分为两个队列，分别接受起始剂量为60mg（共7剂）和90mg（共6剂）的RAG-17鞘内注射，随后剂量以30mg为梯度递增至150mg（5例）或180mg（1例）的维持剂量（图3a）。所有患者均完成了治疗和研究随访（最终访视日期为2024年7月11日）。基线特征显示，患者年龄26-67岁，4例为女性，中位病程33.3个月，基线ALSFRS-R评分为38.2，FVC%为92.5%（表1）。

在主要安全性终点方面，RAG-17总体耐受性良好，截至数据截止日期未发生严重不良事件。治疗期间出现的不良事件发生在33%的参与者中（6人中的2人）。病例1和病例2在首次RAG-17注射后出现短暂、轻度的肌肉震颤（剂量分别为60mg和90mg），自行缓解且后续剂量递增中未再复发，被认为与治疗相关。此外，病例1（有预先存在的脂肪肝和肝功能异常）在180mg剂量前出现无症状的丙氨酸氨基转移酶升高（>基线1.5倍），继续治疗后未进一步升高，被评估为可能与RAG-17及基础疾病均有关。其他不良事件包括头痛（2例次）、跌倒（2例次）、感冒（1例）、发热（1例）、腹痛（1例）、尿路感染（1例）和肢体疼痛（1例）。头痛为体位性，经静脉补液后缓解，被评估为与操作相关的硬膜穿刺后头痛，但与RAG-17无关。除病例1的ALT升高外，未观察到其他有临床意义的实验室指标、生命体征、体格或神经系统检查或心电图的变化。

关键次要终点显示出明确的靶点参与和药效学效应。所有患者的脑脊液SOD1蛋白水平在重复给药后均持续显著下降：队列1（3例，7剂）在第240天较基线平均降低69%，队列2（3例，6剂）在第210天平均降低56%（图3k）。血浆神经丝轻链蛋白水平同样在治疗开始后显著下降。6例参与者中有5例实现显著降低（个体最低点较基线降低约50-85%）。病例1在第120天出现超过60%的初始下降后，至第240天反弹至接近基线水平，与其他5例的持续下降特征不同，因此被排除在汇总纵向分析之外。研究结束时，队列1（第240天）和队列2（第210天）的血浆NfL平均降幅分别为62%和52%。NfL是神经轴突损伤的标志物，其下降趋势在脑脊液中亦有类似反映，这一一致性支持所观察到的NfL降低反映了对神经元完整性的真实治疗效应。研究期间无患者需要有创机械通气或死亡。

图3 | 临床试验设计与患者结局。 a，RAG-17剂量递增研究设计。前三名参与者接受60mg的初始鞘内注射，随后三名参与者从90mg剂量开始。RAG-17通过鞘内注射给药，剂量逐步递增（60、90、120、150mg），最终达到150/180mg的维持剂量（上限为180mg）。最后两次给药代表了最佳剂量水平。b，参与者流程图。c，每位患者ALSFRS-R总分的纵向变化。d，所有患者在不同剂量水平下RAG-17的汇总血浆药代动力学。柱状图代表平均值±标准误；个体数据点（点）叠加显示。每个剂量水平的确切药代动力学样本观察数如下：60mg（n=3个样本），90mg（n=5个样本），120mg（n=7个样本），150mg（n=17个样本）和180mg（n=3个样本）。分析中排除了特定的异常药代动力学值（病例4的第二次和第六次给药；病例5的第一次和第四次给药）。e-j，每位参与者在每次给药后的个体血浆药代动力学曲线——病例1（e）、病例2（f）、病例3（g）、病例4（h）、病例5（i）和病例6（j）。k，以个体患者轨迹呈现的脑脊液SOD1蛋白水平。l，以个体患者轨迹呈现的血浆神经丝轻链蛋白水平。m，每位患者用力肺活量的纵向变化。背景中的水平虚线代表RAG-17的定量下限。 

在探索性终点方面，大多数患者的用力肺活量（FVC%）下降得到延缓，病例3和病例4在研究结束时较基线FVC%有所改善（图3m）。ALSFRS-R评分在各患者间表现不一：病例3在最终访视时改善了4分，病例2下降最为显著（主要由呼吸亚项驱动）。基于基线和病程的事后分层分析显示，基线评分>40的患者（病例1、2、6）治疗前进展率为0.127±0.036分/月，治疗后增至0.423±0.177分/月；基线评分30-40的患者（病例3、5）治疗前进展率为0.838±0.362分/月，治疗后降至-0.107±0.393分/月；基线评分<30的患者（病例4）治疗后略有加速（0.714 vs 0.523分/月）。病程≤21个月的患者治疗后进展率似乎优于病程≥36个月者（图3c）。肌力评估显示大多数参与者未出现明显下降，部分指标有所改善。生活质量和功能量表（改良Norris量表、ALSAQ-40、EQ-5D-5L）显示轻微下降（图4a-c），而焦虑、抑郁和疲劳量表则变化甚微（图4d-f）。肌电图参数（复合肌肉动作电位和运动单位数指数）变化缓慢，而运动单位大小指数逐渐增加。步态功能变化极小或逐渐下降（图4g-h）。临床分期在4名参与者中保持不变，2名出现进展（图4i）。基线7T磁共振磁敏感加权成像显示，6名参与者中有3名存在运动带征（中央前回铁沉积），且在整个研究期间未见明显变化。

图4 | RAG-17在患者中的探索性结局——个体患者临床结局的纵向变化。 Norris量表评分（a）、ALSAQ-40评分（b）、EQ-5D-5L评分（c）、HAMA评分（d）、HAMD评分（e）、FSS评分（f）、通过三维步态分析在多任务条件下评估的步态功能（包括步速（g）、步宽（h））以及Milano-Torino分期（i）。

RAG-17作为一种新型siRNA-ACO偶联物，通过SCAD递送平台实现了功能性siRNA在人类中枢神经系统的递送和强大的靶基因沉默效应，这标志着寡核苷酸疗法发展的一个关键里程碑。该SCAD平台的临床转化验证了其克服siRNA递送难题的能力，有望为其他神经系统靶点开发RNAi疗法。本研究的局限性包括开放标签设计、小样本量、回顾性估算的治疗前进展率（缺乏前瞻性ALSFRS-R数据），以及SOD1突变异质性（部分突变自然史进展较慢）限制了与外部队列的比较。此外，人类和动物研究中缺乏连续的脑脊液细胞数据，无法完全排除潜在的亚临床炎症反应。尽管如此，临床前模型中一致的疗效、稳健的生物标志物应答以及初步的临床信号，均有力支持了RAG-17的持续开发。未来研究应纳入脑脊液细胞计数等炎症谱分析、治疗前观察期以建立可靠的基线进展率，以及神经肌肉接头分析等组织病理学评估。RAG-17不仅为SOD1-ALS患者提供了一种新的潜在治疗选择，也验证了SCAD平台作为下一代神经系统疾病RNAi疗法的可行性。